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1. Préparation des cellules CXCL12, du tampon de dosage et du jurkat pour le test de liaison à la compétition
- Préparer une solution mère de CXCL12AF647 (20 μg/mL ; voir le Tableau des matériaux et des réactifs) en dissolvant le réactif lyophilisé (stocké à -80 °C, dans l’obscurité) dans de l’eau ultrapure additionnée de 0,01 % (volume/volume) de Polysorbate 20. Conservez les aliquotes à usage unique de cette solution mère à -80 °C, à l’abri de la lumière.
- Préparez le tampon d'essai en ajoutant 40 mL de HEPES (1 M, 20 mM de concentration finale) à 200 mL de solution saline équilibrée de Hank's (HBSS, 10x, sans rouge de phénol et sans bicarbonate de sodium, 1x concentration finale). Ajouter de l’eau ultrapure pour obtenir un volume final de 2 L. Ajouter 4 g (0,2 % poids/volume) d’albumine sérique bovine (BSA) et dissoudre la BSA par agitation magnétique. Enfin, ajustez le pH à 7,4 (utilisez du NaOH pour cela) et filtrez la solution à travers des pores de 0,2 μm (voir le tableau des matériaux et des réactifs) à l’aide d’un collecteur sous vide.
REMARQUE : Ce tampon d’essai sera utilisé dans toutes les étapes ultérieures du protocole.
- Comptez le nombre et la viabilité des cellules Jurkat. Pour cela, prélevez un échantillon de la suspension cellulaire et diluez-le dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
note: Nous utilisons régulièrement un analyseur automatisé de viabilité cellulaire (voir Tableau des matériaux et des réactifs) capable de compter les suspensions cellulaires à des concentrations variables. Pour la numération cellulaire, diluer 0,5 mL de suspension cellulaire dans 1,5 mL de PBS (d’autres dilutions, par exemple, 0,1 mL dans 1,9 mL de PBS, sont également possibles). Plusieurs autres appareils sont disponibles dans le commerce pour compter le nombre de cellules et la viabilité qui devraient fonctionner tout aussi bien.
- Prélever le nombre désiré de cellules (c.-à-d. ~24 x 106 cellules pour effectuer l’essai avec une plaque complète de 96 puits) dans un tube stérile de 50 mL par centrifugation (voir le Tableau des matériaux et des réactifs pour le type de centrifugeuse utilisé) à 400 x g pendant 5 min à RT.
- Versez doucement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire. Ajoutez un tampon de dosage frais (par exemple, 20 ml) et remettez les cellules en suspension en pipetant doucement de haut en bas.
- Centrifugez à nouveau les cellules à 400 x g pendant 5 min à RT.
- Videz à nouveau le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de dosage frais pour obtenir une densité de 5 x 106 cellules/mL.
2. Essai de liaison de compétition
REMARQUE : Le test de liaison de compétition réel est effectué à RT et peut être effectué dans des conditions non stériles.
- Diluer les composés étudiés dans un tampon de dosage (voir 1.2) pour obtenir la concentration souhaitée. Préparez soit une concentration fixe de composé pour le dépistage initial (p. ex., concentration finale de 10 μM), soit une série de concentrations de dilution en série pour une caractérisation plus détaillée des composés (p. ex., une série de dilution de 1/3, 1/4 ou 1/5 commençant à 1 μM, concentration finale). Gardez à l’esprit que la solution composée finira par être diluée 2x dans le dosage ; Par conséquent, préparez une solution concentrée 2x.
- Distribuer 100 μL de solution composée (2x concentrée) dans une plaque inférieure ronde transparente à 96 puits (voir le Tableau des matériaux et des réactifs) selon un schéma expérimental prédéfini (p. ex., figure 1C).
REMARQUE : À ce stade, des échantillons de contrôle négatifs et positifs sont inclus dans le dosage. Dans l’échantillon témoin négatif, 100 μL de tampon de dosage sont ajoutés à la place du composé dans les puits de la plaque de 96 puits. Pour l’échantillon de contrôle positif, un tampon de test est également ajouté au cours de cette étape. Voir aussi la figure 1C pour un schéma expérimental typique dans lequel une série de dilutions de plusieurs composés est testée.
- Ajouter 50 μL de suspension cellulaire (voir 1.7 ; 0,25 x 106 cellules) d’un réservoir de réactif dans la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber la plaque pendant 15 min à RT dans l’obscurité.
- Ajouter 50 μL de CXCL12 marqué par fluorescence (c.-à-d. 100 ng/mL de CXCL12AF647 dans un tampon d’essai, 4 fois concentré, concentration finale de 25 ng/mL) à partir d’un réservoir de réactif similaire dans les puits de la plaque de 96 puits. Incuber pendant 30 min à RT dans le noir.
note: Pour les échantillons de contrôle négatifs, ajoutez plutôt un tampon de dosage. Par conséquent, le signal fluorescent détecté dans les échantillons de contrôle négatif correspondra au signal de fond autofluorescent (Figure 1A). Pour les échantillons de contrôle positif, ajouter 50 μL/puits de CXCL12AF647. Les échantillons témoins positifs produiront le signal de fluorescence maximal détecté puisqu’aucune inhibition potentielle par pré-incubation avec des composés n’a été incluse (figure 1A).
- Centrifugez la plaque à 96 puits à 400 x g pendant 5 min à RT. Retirez le surnageant des cellules granulées en retournant la plaque. Séchez l’assiette sur un mouchoir en papier.
- Ajouter 200 μL de tampon d’essai frais provenant d’un réservoir de réactif dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Procédez immédiatement.
- Centrifugez à nouveau la plaque pendant 5 min à 400 x g à RT. Retirez le surnageant en retournant la plaque et séchez-la à nouveau sur un mouchoir en papier.
- Remettez doucement la pastille cellulaire en suspension dans 200 μL de paraformaldéhyde à 1 % dissous dans du PBS. Cette étape permettra de réparer les cellules.
- Poursuivre immédiatement le protocole avec la quantification de la fluorescence par cytométrie en flux.
3. Analyse des échantillons par cytométrie en flux
CXCL12 Les cellulesAF647 sont maintenant prêtes à être analysées par cytométrie en flux. Plusieurs types de cytomètres en flux peuvent être utilisés, mais ils doivent être équipés du laser approprié (c’est-à-dire un laser rouge, plage d’excitation ~630 nm) pour l’excitation et de filtres appropriés pour la détection des fluorophores (filtres d’émission ~660 nm). Ils doivent être capables de manipuler des échantillons dans un format de plaque à 96 puits. Des exemples d’appareils de cytométrie en flux appropriés sont donnés dans le Tableau des matériaux et des réactifs.
- Démarrez l’appareil et ouvrez le logiciel correspondant (voir Tableau des matériaux et des réactifs).
- Sélectionnez les paramètres cellulaires suivants à visualiser au format dot blot : diffusion directe (FSC), diffusion latérale (SSC) et canal de détection fluorophore (CXCL12AF647).
note: Avec le paramètre FSC, les cellules sont discriminées en fonction de leur taille, car l'absorption de lumière détectée est proportionnelle au diamètre de la cellule. Le paramètre SSC, qui mesure la diffusion de la lumière à un angle de 90°, fournit des informations sur la granularité des cellules.
- Choisissez un échantillon (p. ex., un échantillon témoin négatif) pour effectuer le contrôle d’une population cellulaire homogène définie en fonction des paramètres FSC et SSC.
- Sélectionnez l’injection automatique de ~100 μL de cellules fixées de cet échantillon de contrôle négatif dans le cytomètre en flux. Sélectionnez l’option « mélange » avant l’injection et utilisez un débit d’échantillon de 1,5 μL/s.
- Exécutez cet exemple en sélectionnant « Acquérir des données ». Les paramètres FSC et SSC de cet échantillon s’affichent désormais à l’écran.
- Sélectionnez l'outil de contrôle du logiciel. Sur la base de la visualisation par transfert de points FSC et SSC, prédéfinissez une population cellulaire homogène et viable par porte. Pour ce faire, créez un polygone (à l'aide de l'outil de contrôle du logiciel) qui inclut les cellules individuelles distribuées de manière homogène (« événements ») en fonction de ces deux dimensions.
note: La procédure de contrôle vise à définir une population cellulaire homogène et viable qui sera utilisée pour une analyse plus approfondie. Le déclenchement repose sur l’hypothèse que la majorité des cellules viables formeront une population cellulaire homogène sur la base des paramètres FSC et SSC. En effectuant cette étape, les débris cellulaires, les cellules mortes et les agrégats cellulaires peuvent être largement exclus d’une analyse plus approfondie. Une illustration du processus de déclenchement est donnée à la figure 1B.
- Sélectionnez cette option pour analyser 20 000 « événements » (c’est-à-dire des cellules uniques) par échantillon.
note: Cela signifie que pour chaque échantillon, 20 000 cellules qui se trouvent dans la porte prédéfinie seront finalement analysées. L’acquisition des données pour chaque échantillon se poursuivra jusqu’à ce que ce nombre d’événements soit analysé.
- Démarrez l’exécution (sélectionnez « Enregistrer les données »). L’appareil de cytométrie en flux analysera désormais tous les échantillons un par un en enregistrant l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) de chaque échantillon. Cette IFM correspond au signal fluorescent moyen correspondant aux 20 000 cellules qui se trouvent à l’intérieur de la porte prédéfinie.
