1. Génération d’un plasmide qui exprime la construction chimérique
REMARQUE : L’objectif est de générer un plasmide qui exprime le domaine extracellulaire du récepteur d’intérêt fusionné aux domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne CD3ζ de la souris (Figure 1A).
- Récupérer la séquence du domaine extracellulaire du récepteur d’intérêt incluant le peptide signal. Obtenir du matériel d’ADN qui devrait exprimer ce récepteur (p. ex., de l’ADNc ou un plasmide).
- Obtenir du matériel d’ADN qui exprime les domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne CD3ζ de la souris (par exemple, l’ADNc ou un plasmide).
- Concevez la séquence de la protéine de fusion en fonction de la structure générale illustrée à la figure 1A. Assurez-vous que toute la séquence se trouve dans le même cadre de lecture de codon. Cette séquence est utilisée pour concevoir des apprêts appropriés et vérifier le produit final.
- Concevoir deux réactions de PCR pour amplifier séparément chacun des fragments des protéines de fusion (Figure 1B, 1C).
note: Les conditions spécifiques des réactions PCR (par exemple, le temps d’allongement et la température de recuit) dépendent de la nature des amorces, qui sont conçues pour un récepteur spécifique.
- Amplifier le segment extracellulaire du récepteur.
- Concevez une amorce 5' qui comprend une partie du peptide signal du récepteur, une séquence consensus de Kozak et un site de restriction approprié (Figure 1B).
- Concevez une amorce 3' qui flanque les deux parties de la protéine de fusion (Figure 1B). Par exemple, pour la conception initiale, cette amorce 3' peut inclure les 20 dernières paires de bases du segment extracellulaire du récepteur et les 9 premières paires de bases du segment CD3ζ.
note: Il n'est pas nécessaire d'ajouter un site de restriction à l'amorce 3' puisque cette amorce sera utilisée pour générer la séquence fusionnée et n'est pas utilisée pour la ligature.
- Amplifiez le segment CD3ζ.
- Concevez une amorce 5' qui flanque les deux parties de la protéine de fusion (Figure 1C). Par exemple, pour la conception initiale, l'amorce 5' peut inclure les 9 dernières paires de bases du segment extracellulaire du récepteur et les 20 premières paires de bases du segment CD3ζ.
note: Il n'est pas nécessaire d'ajouter un site de restriction à l'amorce 5' puisque cette amorce sera utilisée pour générer la séquence fusionnée et n'est pas utilisée pour la ligature.
- Concevez une amorce 3' qui comprend l'extrémité de la séquence CD3ζ ainsi qu'un site de restriction approprié (Figure 1C).
- Corrigez les séquences d’amorce dans chacune de ces deux réactions afin que la température de recuit soit similaire dans chaque paire (notez que l’amorce, qui comprend les séquences des deux parties de la protéine de fusion, ne recuit qu’avec une partie de la séquence dans chaque réaction).
- Effectuer une PCR supplémentaire dans laquelle un mélange des produits de PCR des deux premières réactions est utilisé comme matrice d'ADN avec l'amorce 5' du segment récepteur extracellulaire (étape 1.4.1.1) et la 3' du segment CD3ζ (étape 1.4.2.2) (figure 1D). Cette réaction devrait générer la séquence de fusion finale.
- Procédez comme d’habitude pour le clonage.
- Comparez le produit final de la PCR au vecteur de coupe cible (le vecteur cible est généralement l’ADNpc3 qui exprime la résistance à G418 et à l’ampicilline).
- Transformer le vecteur ligaturé en bactéries compétentes.
- Décongeler 50 μL des bactéries compétentes sur de la glace.
- Ajouter le vecteur ligaturé à la bactérie et incuber sur de la glace pendant 20 min.
- Incuber à 42 °C pendant 45 s.
- Ajouter 200 μL de LB sans antibiotiques.
- Incuber pendant 1 h à 37 °C en secouant continuellement.
- Semez sur une plaque LB avec les antibiotiques appropriés (p. ex., une solution d’ampicilline à la concentration finale de 0,1 mg/mL).
- Prélever et cultiver plusieurs colonies bactériennes dans 5 mL de LB (dans des tubes de 15 mL).
- Le lendemain, extrayez les plasmides à l’aide d’un mini-kit de préparation.
- Analysez l’insert du gène avec des enzymes de restriction.
- Séquencez les colonies pertinentes et vérifiez que la séquence et le cadre de lecture sont corrects (comme indiqué à l’étape 1.3).
- Transformez le plasmide vérifié en bactéries compétentes.
- Décongeler 20 μL des bactéries compétentes sur de la glace.
- Ajouter 1 μL du plasmide aux bactéries et incuber sur glace pendant 20 min.
- Incuber à 42 °C pendant 45 s.
- Ajouter 200 μL de LB sans antibiotiques.
- Incuber pendant 1 h à 37 °C en secouant continuellement.
- Placez les graines sur une plaque de croissance bactérienne avec les antibiotiques appropriés (p. ex., une solution d’ampicilline à la concentration finale de 0,1 mg/mL).
- Le lendemain, faites pousser une colonie bactérienne dans un grand récipient LB avec 0,1 mg/mL d’ampicilline (~250 mL).
- Le lendemain, effectuez maxi préparation selon les instructions spécifiques fournies par le kit.
note: Pour la procédure d’électroporation, une grande quantité de plasmide est nécessaire, comme détaillé ci-dessous.
2. Transfection du plasmide qui exprime la protéine chimérique dans les cellules BW
REMARQUE : Différentes méthodes peuvent également être utilisées pour la transfection (par exemple, par infection lentivirale). Avant l’électroporation, effectuez une précipitation de l’ADN à l’éthanol comme décrit ci-dessous. Les étapes suivantes nécessitent des conditions stériles.
- La veille, préparez les cellules BW5147 (« cellules BW ») pour l’électroporation. Boîte de 10 plaques (de 10 cm) contenant 10 mL de 100 000 cellules BW5147/mL (c.-à-d. un total de 10 x 106 cellules) avec RPMI complété par 10 % de sérum de veau fœtal (SCF), 1 % de pyruvate de sodium, 1 % de L-glutamine, 1 % d’acides aminés non essentiels et 1 % de pénicilline-streptomycine (« milieu complet »).
- Placez 100 μg du plasmide pcDNA3 qui exprime la protéine de fusion dans un tube de 1,5 à 2 mL et ajoutez-y de l’acétate de sodium 3 M à un pH de 5,3 à 5,5. Le volume de l’acétate de sodium doit correspondre à 0,1 (10 %) du volume du plasmide de 100 μg ; titrer le pH de l’acétate de sodium à l’aide d’un pH-mètre en ajoutant du NaOH ou du HCl.
- Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 100 % au mélange du plasmide et de l’acétate de sodium comme décrit à l’étape 2.2 (2,5 fois le volume total du plasmide et de l’acétate de sodium). Incuber une nuit à -20 °C ou pendant 2 h à 70 °C.
- 24 h après la mise en plaque des cellules d’eau biologique, prélever toutes les cellules d’eau d’origine biologique (~100 mL) dans 2 tubes de 50 mL. Centrifugez les cellules pendant 5 min à 515 x g et jetez le surnageant.
- Remettez la pastille en suspension des deux tubes dans 25 mL de RPMI- dans un seul tube de 50 mL. Par exemple, réinsérez la pastille d’un tube avec 25 mL de RPMI, puis utilisez ce fluide pour remettre en suspension le liquide dans l’autre tube de 50 mL de sorte que la totalité de la pastille des cellules BW soit remise en suspension dans 25 mL de milieu dans un seul tube.
note: Le milieu doit être sans ajouts car le sérum pourrait interférer avec l’électroporation.
- Centrifugez à nouveau les cellules pendant 5 min à 515 x g. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de RPMI et transférez le contenu dans une cuvette de 0,4 cm sur de la glace.
- Centrifugez le plasmide qui a subi une précipitation d’éthanol (étape 2.3) pendant 30 min à 16 000 x g et 4 °C.
- Laver une fois avec 1 ml d’éthanol à 70 % et centrifuger pendant encore 20 minutes à 16 000 x g et 4 °C (pour éliminer le sel).
- Retirez tout l’éthanol et laissez sécher légèrement la pastille (c’est-à-dire dans un tube ouvert dans le capuchon de culture tissulaire). Remettez le granulé en suspension avec 100 μL de RPMI préalablement chauffé à 60 °C.
- Ajouter le plasmide remis en suspension (étape 2.8) aux cellules de la cuvette et incuber pendant 5 min sur de la glace.
- Électroporat les cellules à 0,23 kV, capacité de 250. Cela devrait prendre ~4 ms.
- Transférez les cellules électroporées dans un tube de 50 ml, ajoutez 50 ml de milieu complet et centrifugez pendant 5 min à 5,15 x g.
- Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 50 mL de milieu complet.
- Plaquez les cellules électroporées dans des boîtes de culture à 24 puits (1 mL par puits, pour un total de ~50 puits) et incubez à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 48 h.
- Sélectionnez les cellules transfectées avec des antibiotiques. Après 48 h, ajouter 1 mL de milieu complet complété par 10 mg/mL de G418 dans chaque puits (à ce stade, le volume final dans chaque puits est de 2 mL et la concentration finale de G418 dans chaque puits est de 5 mg/mL).
note: Si le plasmide contient une résistance aux antibiotiques différente, déterminez la concentration d’antibiotiques nécessaire pour tuer les cellules BW non transfectées avant cette étape.
- Toutes les 48 heures, jeter soigneusement 1 mL du volume supérieur de chaque puits sans remuer le milieu dans le puits (les cellules BW ont tendance à être au fond du puits). Ajouter un milieu complet complété par 5 mg/mL de G418 dans chaque puits, de sorte que le volume final dans chaque puits soit de nouveau de 2 mL.
- Examinez régulièrement les plaques de culture pour détecter la croissance cellulaire dans tous les puits.
note: Un changement de couleur du milieu en jaune peut aider à identifier les cellules en croissance ; cependant, au début, le support sera jaune à cause du G418 lui-même. Identifiez les puits positifs (puits avec des cellules en croissance). Ces puits sont résistants à G418 et devraient donc exprimer la protéine de fusion. Ce processus prend généralement ~3 semaines.
3. Vérification de l’expression du récepteur transfecté dans les cellules des puits positifs.
- Colorer les cellules BW transfectées avec un anticorps spécifique contre le récepteur qui a été transfecté.
- Comparer le niveau d’expression du récepteur par cytométrie en flux à l’expression des cellules témoins (cellules BW non transfectées).
- Après vérification d’un ou de plusieurs puits, utilisez immédiatement les cellules à des fins expérimentales, cultivez-les en culture ou congelez-les pour des applications futures.
- Vérifiez l’expression du récepteur transfecté avant d’effectuer une nouvelle expérience. Après quelques semaines de croissance, les cellules avec G418 avec une expression de récepteur stable, G418 peuvent être omises du milieu de culture.
4. Incubation des cellules BW transfectées avec des cibles
REMARQUE : Lors de la première utilisation des cellules BW transfectées, il est préférable de les tester sur des cibles qui expriment un ligand connu du récepteur d’intérêt ou sur des anticorps liés à des plaques spécifiquement dirigés contre le récepteur d’intérêt (expériences de réticulation ; voir ci-dessous, section 4.2.1.3).
- De préférence, divisez les cellules BW 24 h avant l’expérience (par exemple, en ajoutant 10 mL de milieu complet à 2 mL de cellules en culture dans une nouvelle plaque de culture de 10 cm).
- Incuber les cellules BW transfectées avec leurs cibles. Effectuez l’expérience simultanément sur des cellules BW témoins qui expriment un vecteur vide (ou cellules BW parentales). Les plaques 96F sont préférables (mais les plaques 96U peuvent également être utilisées). Réalisez l’expérience en trois exemplaires. Mettez en suspension toutes les cellules dans le milieu complet.
- Préparez les cibles. Le type de cible varie en fonction de l’objectif et peut être des cellules, des cellules qui ont été pré-incubées avec des anticorps ou des anticorps seuls. Ce système a également été utilisé avec des bactéries comme cibles.
- Si les cibles sont des cellules en division (c’est-à-dire des lignées cellulaires), irradiez-les à 6 000 rad avant le test. Placez 50 000 cellules cibles dans un seul puits d’une plaque de 96 (dans un volume de 100 μL).
- Pour les expériences avec des anticorps et des cellules BW qui expriment des FcγR humains, incuber les cellules cibles avec un anticorps sur glace dans une plaque à 96 puits (par exemple, 50 μL des cellules cibles et 50 μL de l’anticorps ; différentes doses d’anticorps peuvent être testées).
- Si vous utilisez des anticorps seuls comme cibles (expériences de réticulation), ils doivent être liés à des plaques. Pour ce faire, incubez d’abord les anticorps dans un milieu complet dans une plaque à 96 °F pendant 1 à 2 h à 37 °C et 5 % de CO2 (une dose initiale typique est de 0,5 μg d’un anticorps spécifique dans 50 μL). Lavez la plaque pour éliminer les anticorps non liés.
note: Dans ce cas, une plaque 96F permettra la liaison de l’anticorps à la plaque, ce qui, après l’ajout des cellules BW transfectées, conduira à l’activation du récepteur transfecté.
- Ajoutez les cellules BW (cellules effectrices). Placez 50 000 cellules BW dans un seul puits d’une plaque de 96 (dans un volume de 100 μL).
- Compléter le volume dans chaque puits à 200 μL si nécessaire.
- Incuber les plaques à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 48 h (cette période peut être calibrée).
- Après 48 h, congelez les plaques à -20°C et décongelez-les avant l’ELISA, ou utilisez-les immédiatement pour l’ELISA (voir les prochaines étapes).
5. ELISA
- Enduisez une plaque ELISA d’un anticorps anti-IL-2 de souris (anti-mIL-2). Placez 0,05 μg d’anti-mIL-2 dans un volume de 50 μL de 1x PBS (tampon phosphate salin) par puits. Incuber la plaque ELISA enrobée avec l’anticorps anti-mIL-2 à 4 °C pendant la nuit ou à 37 °C pendant 2 h
note: Pour effectuer l’ELISA directement après l’étape d’incubation, la plaque ELISA doit être enduite 24 h avant la fin de la période d’incubation des cellules BW.
- Jeter le liquide dans la plaque ELISA et ajouter une solution bloquante (200 μL par puits) composée de 1 x PBS et de 1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber la plaque ELISA pendant 2 h à température ambiante.
- Lavez la plaque ELISA trois fois avec une solution de PBS Tween à 0,05 % (c’est-à-dire 0,5 ml de Tween-20 dans 1 litre de 1x PBS).
- Prenez la plaque 96 qui contient les cellules BW qui ont été incubées avec leurs cibles (4.3). Si la plaque a été congelée, la décongeler complètement (p. ex., par une courte incubation à 37 °C). Centrifuger la plaque à 96 puits (5 min, 515 x g) et transférer soigneusement 100 μL du surnageant dans chaque puits sur la plaque ELISA pré-enduite et bloquée.
note: Le surnageant doit être prélevé sur les côtés de chaque puits pour éviter d’emporter les cellules.
- Si vous le souhaitez, ajoutez de la mIL-2 recombinante avec des concentrations définies à l’une des rangées vides de la plaque ELISA revêtue pour générer une courbe standard de mIL-2. Par exemple, commencer à partir d’une concentration de mIL-2 de 2 500 pg/mL, puis diminuer de 50 % dans chaque puits subséquent ; ne pas ajouter de mIL-2 dans le dernier puits.
- Incuber la plaque ELISA à 4 °C pendant la nuit ou à 37 °C pendant 2 h.
- Lavez la plaque ELISA quatre fois avec PBS Tween.
- Ajoutez de la biotine anti-souris IL-2 à la plaque ELISA. Utilisez une concentration de 1 μg d’anticorps dans 1 mL de 1x PBS avec 1 % BSA et divisez en 100 μL par puits.
- Incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Lavez la plaque ELISA six fois avec PBS Tween.
- Ajouter la streptavidine conjuguée à la HRP. Utilisez une concentration de 1 μL de streptavidine dans 1 mL de PBSX1 avec 1 % de BSA et divisez-la en 100 μL par puits.
- Incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Lavez la plaque ELISA six fois avec PBS Tween.
- Ajouter 100 μL par puits de solution de substrat TMB. Terminez cette étape rapidement afin de minimiser les différences entre les puits dues aux décalages temporels lors de l’ajout du TMB.
- Lire la plaque ELISA avec un lecteur de plaques ELISA à 650 nm (la lecture peut être répétée si le signal est faible).
