Sonde de force biomembranaire pour quantifier les interactions récepteur-ligand

Résumé

Source : Chen, Y., et al., Sonde de force biomembranaire de fluorescence : quantification simultanée de la cinétique récepteur-ligand et de la signalisation intracellulaire induite par la liaison sur une seule cellule. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, les sondes de force biomembranaire (BFP) sont utilisées pour mesurer les forces entre les récepteurs et les ligands. Cette technique permet de détecter les interactions en surveillant la pression nécessaire pour rompre les liaisons entre le pMHC conjugué sur les billes de la sonde et les TCR sur les cellules cibles.

Protocole

1. Isolement des globules rouges humains, biotinylation et ajustement de l’osmolarité

REMARQUE : L’étape 1.1 doit être effectuée par un professionnel de la santé qualifié, tel qu’une infirmière, avec un protocole approuvé par l’Institutional Review Board.

1. Prélevez 8 à 10 μl (une goutte) de sang à partir d’une piqûre au doigt et ajoutez-le à 1 ml de tampon carbonate/bicarbonate (liste des matériaux). Manipulez doucement le mélange au vortex ou à la pipette et centrifugez-le pendant 1 min à 900 x g. Jetez le surnageant et lavez-le à nouveau.
2. Dans un petit bécher, pesez 3,5 à 4 mg de l’agent de liaison Biotine-PEG3500-NHS (liste des matériaux). Dissoudre-le dans le tampon carbonate/bicarbonate pour obtenir une concentration finale de 3 mg/ml.
3. Mélangez 171 μl de tampon carbonate/bicarbonate, 10 μl de globules rouges et 1049 μl de solution de liaison Biotine-PEG3500-NHS et incubez à RT pendant 30 min. Lavez les globules rouges une fois avec un tampon carbonate/bicarbonate, puis deux fois avec un tampon N2-5 % (liste des matériaux).
4. Pendant ce temps, placez le flacon de liaison avec un bouchon desserré dans un dessiccateur sous vide en verre rempli de déshydratants au fond et mettez l’aspirateur pendant 5 min, puis remplissez le dessiccateur d’argon. Serrez le bouchon et sortez la bouteille. Fermez la bouteille avec un film de paraffine plastique (liste des matériaux), placez-la dans un récipient rempli de déshydratants au fond et rangez-la à -20 °C
   note: Les étapes qui impliquent l’utilisation de l’agent de liaison Biotin-PEG3500-NHS, y compris 1.2-1.4 (à l’exception de l’incubation et du lavage dans 1.3), doivent être effectuées aussi rapidement que possible.
5. Diluer la nystatine dans un tampon N2-5 % pour obtenir une concentration finale de 40 μg/ml. Mélanger 5 μl de globules rouges biotinylés avec 71,4 μl de solution de nystatine (liste des matériaux) et incuber pendant 1 heure à 0 °C. Laver deux fois avec un tampon N2-5 % et conserver avec un tampon N2-5 % + 0,5 % BSA (liste des matériaux) au réfrigérateur (4 °C).

2. Silanisation des billes de verre

1. Nettoyage de la surface du cordon
   1. Pesez 50 mg de poudre de billes de verre et mettez-les à nouveau en suspension dans 500 μl d’eau DI.
   2. Mélangez 0,5 ml de 30 % H₂O₂ (liste des matériaux) avec 9,5 ml d’eau DI dans un bécher de 50 ml, puis ajoutez 2 ml de NH₄OH concentré (liste des matériaux) et apportez cette solution dans une chaudière sur une plaque chauffante.
   3. Ajoutez les billes de verre à la solution bouillante et continuez à bouillir pendant encore 5 min. Agitez doucement la solution toutes les minutes.
   4. Après ébullition, transférez ~5 ml de cette suspension de billes chaudes dans un tube de micro-centrifugeuse de 15 ml et complétez avec de l’eau RT DI. Centrifugez à 3 500 x g pendant 5 min, retirez et jetez le surnageant.
   5. Transférez encore 5 ml de suspension de billes chaudes et ajoutez-les aux billes lavées, complétez avec plus d’eau DI, mélangez bien et centrifugez à nouveau. Répétez cette procédure jusqu’à ce qu’environ 50 ml d’eau DI soient utilisés, ce qui représentera un total de 4 à 5 lavages.
   6. Transvasez la suspension de billes dans un flacon de 1 ml. Répétez le lavage des billes avec du méthanol (liste des matériaux) par centrifugation à 17 000 x g pendant 5 min 3 fois, et enfin remettez les billes en suspension dans 1 ml de méthanol à 100 %.
2. Thiolation de la surface du talon
   1. Dans un tube à centrifuger de 50 ml, ajoutez 45,6 ml de méthanol, 0,4 ml d’acide acétique (liste des matériaux), 1,85 ml d’eau DI, 1,15 ml de 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) (liste des matériaux) et 1 ml de billes de suspension préparées en 2.1, puis incubez à RT pendant 3 heures.
   2. Après la réaction, éliminez tous les réactifs en les lavant une fois avec du méthanol frais, et remettez les billes en suspension dans 500 μl de méthanol. Répartissez uniformément cette suspension de billes de verre concentrée en un ensemble de 20 flacons en verre secs et propres avec des bouchons à vis. Évaporez le méthanol à l’aide d’un jet d’argon sec et tournez lentement les flacons de manière à former une fine couche de billes sèches sur les côtés de chaque flacon.
   3. Placez les flacons de billes dans une étuve de séchage préchauffée à 120 °C pendant 5 min, puis retirez-les et placez rapidement le(s) bouchon(s) sans serrer. Placez les flacons dans un dessiccateur sous vide en verre rempli de déshydratants dans le fond et aspirez le dessiccateur avec une pompe à vide jusqu’à ce qu’il refroidisse.
   4. Purgez le dessiccateur aspiré avec de l’argon sec pour amener le dessiccateur à la pression atmosphérique normale. Retirez le couvercle du dessiccateur et resserrez rapidement le(s) bouchon(s) du flacon. Fermez les flacons avec un film de paraffine plastique et stockez-les chez RT dans une boîte de stockage sombre et sèche.
   5. En cas d’utilisation immédiate, prendre un flacon de billes sèches et laver une fois avec un tampon phosphate (liste des matériaux), remettre en suspension dans 50 μl de tampon phosphate et conserver à 4 °C. Cette préparation concentrée de billes sera appelée « billes MPTMS » dans les étapes suivantes.
      note: Avec un stockage approprié, les billes MPTMS pourraient rester fonctionnelles jusqu’à trois mois.

3. Fonctionnalisation des billes

1. Enrobage covalent de protéines sur des billes
   1. Prenez un certain volume (par exemple, 2,5 μl) du stock de protéines et mélangez-le avec un volume égal de tampon carbonate/bicarbonate pour obtenir une solution 1,
      note: Le volume dépend de la concentration du stock et de la densité finale souhaitée de la protéine à la surface des billes.
   2. Dans un petit bécher, peser 2 à 3 mg de l’agent de liaison MAL-PEG3500-NHS (liste des matériaux) et le dissoudre avec un tampon carbonate/bicarbonate pour atteindre une concentration finale de 0,231 mg/ml.
   3. Mélanger la solution 1 avec un volume égal de la solution de l’agent de liaison préparée en 3.1.2. Incuber le mélange à RT pendant 30 min pour obtenir la solution 2.
   4. Pendant ce temps, placez le flacon de liaison avec un bouchon desserré dans un dessiccateur sous vide en verre rempli de déshydratants au fond et mettez l’aspirateur pendant 5 min, puis remplissez le dessiccateur d’argon. Serrez le bouchon et sortez la bouteille. Fermez la bouteille avec un film de paraffine plastique, placez-la dans un récipient rempli de déshydratants sur le fond et conservez-la à -20 °C
      note: Les étapes qui impliquent l’utilisation de l’agent de liaison MAL-PEG3500-NHS, y compris 3.1.2-3.1.4 (à l’exception de l’incubation en 3.1.3), doivent être accomplies le plus rapidement possible.
   5. Mélangez 5 μl de billes MPTMS avec la solution 2 et ajoutez un tampon phosphate (liste des matériaux) pour obtenir un volume final de 250 μl.
   6. Incuber les billes pendant la nuit à RT, laver 3 fois avec un tampon de phosphate, puis les remettre en suspension dans 100 μl de tampon de phosphate et les conserver à 4 °C.
2. Préparation de billes enrobées de protéines/streptavidine (SA)
   1. Suivez le protocole 3.1.1-3.1.4.
   2. Mélangez 5 μl de billes MPTMS avec la solution 2 et 5 μl de solution de streptavidine-maléimide à 4 mg/ml (SA-MAL) (liste des matériaux), puis ajoutez un tampon phosphate pour obtenir un volume final de 250 μl.
   3. Incuber les billes pendant la nuit à RT, laver 3 fois avec un tampon phosphate, et enfin remettre en suspension dans 100 μl de tampon phosphate et stocker à 4 °C.
3. Enrobage de streptavidine sur des billes de verre
   1. Mélanger 5 μl de billes MPTMS avec 5 μl de solution SA à 4 mg/ml et ajouter 140 μl de tampon phosphate
   .
   2. Incuber les billes pendant la nuit à RT, laver 3 fois avec un tampon phosphate, les remettre en suspension dans 50 μl de tampon phosphate et les stocker à 4 °C.
4. Enrobage des billes enrobées SA avec une protéine biotinylée
   1. Mélangez 5 μl de billes enrobées d’acide soufrénétique avec la protéine (volume dépendant de la densité d’enrobage souhaitée) et ajoutez un tampon phosphate pour obtenir un volume final de 100 μl.
   2. Incuber le mélange pendant la nuit à 4 °C ou pendant 3 heures à RT, laver 3 fois avec un tampon phosphate, puis le remettre en suspension dans un tampon phosphate de 50 μl et le conserver à 4 °C.

4. Préparation des cellules

REMARQUE : Pour purifier les cellules, suivez les protocoles standard de purification cellulaire correspondant au type de cellules utilisées, par exemple, les cellules T ou certaines lignées cellulaires.

1. Pour les expériences fBFP, une fois la suspension cellulaire préparée, ajoutez du Fura2-AM (liste des matériaux) dissous dans du DMSO dans la suspension cellulaire pour atteindre une concentration finale de 2 μM, incubez pendant 30 min à RT, puis lavez une fois. Conservez cette suspension cellulaire chargée par fluorescence dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.

5. Préparation pour des micropipettes et une chambre cellulaire

1. Préparation des micropipettes
   1. Coupez de longs tubes de verre capillaire (liste des matériaux) avec un coupe-verre en petits morceaux d’environ 3 pouces de longueur. Montez une pièce sur l’extracteur de micropipette (liste des matériaux), cliquez sur le bouton « Tirer » pour que le milieu du capillaire soit chauffé par la machine et que le capillaire soit tiré sur les deux extrémités pour faire deux capillaires à pointes pointues (micropipettes brutes).
      note: En suivant la directive du produit, la morphologie souhaitée de la pipette brute a un cône de 6 à 8 mm et une pointe de 0,1 à 0,5 μm.
   2. Montez une pipette brute sur le porte-pipette de la forge à micropipettes (liste des matériaux). Chauffer pour faire fondre la sphère de verre sur la forge. Insérez l’extrémité de la pipette brute à l’intérieur de la sphère de verre. Refroidissez la sphère de verre et tirez sur la pipette brute pour la casser de l’extérieur et laisser son embout à l’intérieur de la sphère. Répétez cette procédure jusqu’à ce que l’orifice de pointe souhaité soit obtenu.
      note: Exemples de diamètre intérieur de la pointe d’une micropipette : 2,0-2,4 μm pour un globule rouge, ~1,5 μm pour une bille, ~2-4 μm pour une cellule T et -7 μm pour une cellule hybride.
2. Construction d’une chambre cellulaire
   REMARQUE : la chambre cellulaire est construite sur la base d’un support de chambre fait maison, qui se compose de deux pièces de carrés métalliques (cuivre/aluminium) et d’une poignée qui les relie ensemble (figure 1D).
3. Découpez une lamelle de 40 mm x 22 mm x 0,2 mm à l’aide d’un coupe-verre en deux morceaux de 40 mm x 11 mm x 0,2 mm (lamelles 1 et 2). Collez la lamelle 1 en graissant sur la face supérieure du support de chambre de manière à ce qu’elle relie les deux carrés métalliques, et collez de la même manière la lamelle 2 sur la face inférieure, ce qui formera une chambre cellulaire à lamelle parallèle (Figure 1D).
4. À l’aide d’une pipette, injectez 200 μl de tampon expérimental entre les deux lamelles. Assurez-vous que la mémoire tampon se fixe aux deux lamelles. Tournez doucement et secouez la chambre pour laisser le tampon toucher les deux extrémités de la chambre.
5. Injectez soigneusement de l’huile minérale des deux côtés de la chambre qui flanque la zone tampon expérimentale, scellant ainsi le tampon de l’air libre. Injectez des suspensions de billes de sonde (par exemple, des billes recouvertes de pMHC), de globules rouges et de cibles (par exemple, des cellules T) dans les régions supérieure, moyenne et inférieure de la zone tampon respectivement.

4. Expérience BFP

1. Allumez le microscope (liste des matériaux) et la source lumineuse. Placez la chambre sur la platine principale du microscope (Figure 1A, D).
2. Installez les trois micropipettes de BFP (Figure 1D. À gauche : sonde, pour saisir un RBC, à droite : cible, pour saisir une cellule ou une perle, en bas à droite : helper, pour saisir une perle).
   1. À l’aide d’un micro-injecteur (liste des matériaux), remplissez une micropipette avec un tampon expérimental. Retirez le porte-pipette (liste des matériaux) et maintenez-le à un endroit plus bas pour permettre à l’eau de s’écouler de la pointe. Insérez rapidement la micropipette dans l’embout du support et assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne pénètre dans la micropipette pendant l’insertion. Serrez la vis du support.
   2. Montez chaque porte-pipette sur le micro-manipulateur correspondant. Poussez la micropipette vers la chambre de manière à ce que ses pointes pénètrent dans la zone tampon de la chambre. Ajustez la position de la micropipette et trouvez-les sous le champ de vision du microscope.
3. Déplacez-vous dans l’étage du support de chambre pour trouver les colonies de trois éléments (les globules rouges, les cibles et les perles de sonde) une par une. Ajustez la position de la micropipette correspondante en tournant les boutons des manipulateurs pour laisser la pointe de la micropipette s’approcher d’une cellule/bille. Aspirez la cellule/la bille en ajustant la pression à l’intérieur de la micropipette correspondante. Les trois micropipettes captureront les éléments correspondants.
4. Déplacez-vous autour de l’étage du support de chambre pour trouver un espace ouvert loin des colonies des éléments injectés où l’expérience sera réalisée. Basculez le mode visuel du microscope pour visualiser l’image sur le programme informatique sur l’écran de l’ordinateur. Déplacez les trois éléments des pointes de pipette dans le champ de vision du programme.
5. Alignez le cordon de la sonde et le globule rouge, et manœuvrez soigneusement le cordon de la sonde jusqu’au sommet du globule rouge, enfoncez brièvement le cordon sur le globule rouge et rétractez-le doucement. Ajustez la pression de la micropipette auxiliaire pour souffler doucement la perle, de sorte qu’elle reste collée sur l’apex du globule rouge rouge (figure 1F). Éloignez la micropipette auxiliaire et alignez la cible et la perle de la sonde (Figure 2A).
6. Sur le programme, dans la fenêtre du champ de vision, utilisez les outils du programme pour mesurer les rayons respectifs de la micropipette de la sonde (Rp), du RBC (R0), de la surface de contact circulaire entre le RBC et la bille de la sonde (Rc), ce qui permet d’estimer la constante de ressort du RBC (k) par l’équation suivante, où Δp est la pression d’aspiration à l’extrémité de la pipette de la sonde. Remarque : Il découle de la loi de Hooke que la force de liaison, F, peut être quantifiée par le produit de la constante de ressort et du déplacement du cordon de la sonde (d), c'est-à-dire F = d (Figure 2C).
   

Résultats

Figure 1 : Assemblage du fBFP.

(A) Une vue d’ensemble du système matériel fBFP. (B) Un dessin schématique du système matériel fBFP. (C) Le système à double caméra « DC2 » (orange) sur lequel la caméra haute vitesse (bleue) et une caméra à fluorescence (blanche) ont été montées. (D) La platine de mi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	Réf. S9638	Préparation de tampon phosphate
Anhy. Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Préparation de tampon phosphate
Carbonate de sodium (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Préparation d’un tampon carbonate/bicarbonate
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Préparation d’un tampon carbonate/bicarbonate
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	Réf. S7653	Préparation du tampon N2-5 %
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Préparation du tampon N2-5 %
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	Réf. P5655	Préparation du tampon N2-5 %
saccharose	Sigma-Aldrich	S0389	Préparation du tampon N2-5 %
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	Référence A5002-1	Fonctionnalisation des billes
Biotine-PEG3500-NHS	JenKem	N° A5026-1	Biotinylation des globules rouges
Nystatine	Sigma-Aldrich	N° N6261	Ajustement de l’osmolarité des globules rouges
Hydroxyde d’ammonium (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Silanisation des billes de verre
méthanol	BDH	Référence 67-56-1	Silanisation des billes de verre
30 % de peroxyde d’hydrogène (H2O2)	J. T. Barker	janv.-86	Silanisation des billes de verre
Acide acétique (glacial)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Silanisation des billes de verre
3-Mercaptopropyltriméthoxysilane (MPTMS)	Uct Specialties, llc	Référence 4420-74-0	Fonctionnalisation des billes de verre
Perles de verre borosilicate	Technologie des particules Distrilab	Référence 9002	Fonctionnalisation des billes de verre
Streptavidine-Maléimide	Sigma-Aldrich	Réf. S9415	Fonctionnalisation des billes de verre
Bsa	Sigma-Aldrich	A0336	Fonctionnalisation du ligand
Fura2-AM	Technologies de la vie	F-1201	Chargement intracellulaire du colorant par fluorescence calcique
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Chargement intracellulaire du colorant par fluorescence calcique
Perles de PE quantibrite	BD Biosciences	340495	Quantification de la masse volumique
Tube capillaire 0,7-1,0 mm x 30 pouces	Kimble Chase	Référence 46485-1	Fabrication de micropipettes
Extracteur de micropipette flamboyant/brun	Instrument de sutter	P-97	Fabrication de micropipettes
Narishige	Narishige	Narishige	Fabrication de micropipettes
huile minérale	Fisher Scientific	Réf. BP2629-1	Assemblage de la chambre
Verre de protection de microscope	Fisher Scientific	Référence 12-544-G	Assemblage de la chambre
Micro-injecteur	Instruments de précision mondiaux	Référence MF34G-5	Assemblage de la chambre
Seringue de 1 ml	Bd	309602	Assemblage de la chambre
Porte-micropipette	Narishige	HI-7	Assemblage de la chambre
Microscope (TiE inversé)	Nikon	MEA53100	Système BFP
Objectif CFI Plan Fluor 40x (NA 0,75, WD 0,72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	Système BFP
Caméra, GE680, 640 x 480, GigE, CCD 1/3", mono	Imagerie Graftek	02-2020C	Système BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", monture C, 1280 x 960, mono, CCD, ADC 12 bits	Imagerie Graftek	Référence 02-2185A	Système BFP
Tête de sonde submicronique manuelle avec télécommande haute résolution	Karl Suss	PH400	Système BFP
Table anti-vibration (5' x 3')	TMC	77049089	Système BFP
Étape de traduction manuelle 3D	Newport	462-XYZ-M
Logiciel de CAO 3D SolidWorks	Logiciel de CAO 3D SolidWorks	Version 2012 SP5	Système BFP
Logiciel LabVIEW	National Instruments	Version 2009	Système BFP, programme BFP
Platine de translation piézoélectrique 3D	Physik Instrumente	M-105.3P	Système BFP
Capteur piézoélectrique linéaire	Physik Instrumente	P-753.1CD	Système BFP
Tampon carbonate/bicarbonate (pH 8,5)			8,4 g/L de carbonate de sodium (Na2CO3), 10,6 g/L de bicarbonate de sodium (NaHCO3)
Tampon N2-5 % (pH 7,2)			27,6 g/L de NaPhosphate monobasique (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L d’Anhy. NaPhosphate dibasique (Na2HPO4)
			20,77 g/L de chlorure de potassium (KCl), 2,38 g/L de chlorure de sodium (NaCl), 0,13 g/L de phosphate de potassium monobasique (KH2PO4), 0,71 g/L de phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4), 9,70 g/L de saccharose