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1. Purification de la GTPase marquée GST
- Cultiver une souche d’E. coli telle que BL21 transformée avec pGEX-Rac1 O/N à 37 °C, en agitant à 220 tr/min, dans 500 ml de milieu d’autoinduction (25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,5 % de glycérol, 0,05 % de glucose, 0,2 % de lactose, 5 g de tryptone, 2,5 g d’extrait de levure, 100 μg/ml d’ampicilline).
- Récoltez les bactéries par centrifugation pendant 10 min à 10 000 x g, 4 °C.
- Remettre en suspension la pastille bactérienne dans 20 ml de réactif d’extraction de protéines, 1x inhibiteur de protéase, et incuber pendant 20 min à RT avec inversion.
- Clarifier le lysat par centrifugation à 40 000 x g pendant 30 min.
- Ajouter 2 ml de billes magnétiques de glutathion, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS : 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Incuber pendant 2 h en mélangeant par inversion à 4 °C.
- Lavez quatre fois les billes chargées de protéines avec 10 ml de PBS, à l’aide d’un trieur de particules magnétiques pour précipiter les billes à chaque étape.
- Remettre en suspension les billes chargées de protéines dans 2 ml de PBS et les stocker à -80 °C dans des aliquotes de 100 μl jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
2. Expression des protéines de liaison à la GTPase
- La veille de l’expérience, des plasmides transfectifs codant pour les versions marquées par la protéine fluorescente verte (GFP) de chaque protéine de liaison à la GTPase dans un flacon séparé de 75 cm2 de HEK293T comme suit. Pour valider la charge nucléotidique, transfectez TrioD1 marqué GFP dans une troisième fiole de 75 cm2 de HEK293T.
- Diluer la polyéthylamine à 1 mg/ml dans 100 μl de NaCl stérile 150 mM.
- Ajouter 27 μl de polyéthylamine diluée à 223 μl de milieu sérique réduit.
- Ajoutez 12 μg d’ADN plasmidique à 250 μl de milieu sérique réduit.
- Incuber chaque tube pendant 2 min à RT.
- Combinez les mélanges de polyéthylamine et d’ADN dans un seul tube et tourbillonnez pendant 2 min.
- Incuber pendant 15-20 min à RT.
- Remplacer le milieu de culture (milieu Eagle modifié de Dulbecco, 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, pas d'antibiotiques) sur du HEK293T confluent à 90 % par 5 ml de milieu de croissance frais.
- Ajouter le mélange combiné de polyéthylamine/ADN dans la fiole et incuber O/N à 37 °C, 5 % CO2.
3. Purification des protéines de liaison à la GTPase
- Rincer les fioles des cellules transfectées dans du PBS et égoutter la fiole pendant 5 min, en aspirant le liquide libre.
- Grattez les cellules dans un tampon de lyse de 500 μl (50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 1 % de Nonidet P-40, 1x inhibiteur de protéase) dans un tube à microfuge.
- Lyser les cellules par mélange par inversion à 4 °C pendant 30 min.
- Pendant la lyse, laver trois fois deux lots de billes GFP-Trap de 40 μl avec un tampon de lyse frais, en sédimentant les billes à 2 700 x g pendant 2 minutes entre les lavages.
- Clarifier les lysats par centrifugation à 21 000 x g pendant 10 min.
- Transférez le lysat clarifié de chacune des protéines concurrentes dans des billes de piège GFP lavées séparées et laissez les protéines de fusion GFP se lier pendant 2 heures, en les mélangeant par inversion à 4 °C. Conservez le lysat des cellules GFP-TrioD1 sur de la glace.
- Laver deux fois les billes de GFP-Trap dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM de NaCl, 0,7 % (p/v) Nonidet P-40 et deux fois dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2, et de sédimenter les billes à 2 700 x g pendant 2 min entre les lavages.
- Eluter les protéines de fusion GFP en ajoutant 40 μl de glycine 0,2 M (pH 2,5) et en pipetant de haut en bas pendant 30 secondes. Sédimenter immédiatement les billes à 21 000 x g pendant 60 s et transférer le liquide dans un nouveau tube de microfuge contenant 4 μl 1 M de Tris-HCl (pH 10,4). Faites-le rapidement pour limiter les dommages à la protéine purifiée.
- Analyser 1 μl de chaque protéine purifiée par Western blot et sonder avec un anticorps anti-GFP pour établir le rendement relatif à l'aide d'un système de transfert quantitatif selon le protocole du fabricant. Alternativement, déterminer les concentrations de protéines à l’aide d’un dosage de l’acide bicinchoninique (BCA), mais cela introduit des erreurs si les protéines ne réagissent pas de manière identique avec le test ou s’il y a des protéines contaminantes.
- Égaliser la concentration molaire en protéines par l’ajout de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) et de 20 mM de MgCl2.
4. Charge nucléotidique de la GTPase
- Décongelez une aliquote de billes magnétiques GST-Rac1, préparée à l’étape 1.
- Prenez 90 μl de billes GST-Rac1 et lavez-les trois fois avec 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM de NaCl, 0,1 mM de DTT et 4 mM d’EDTA, à l’aide d’un trieur de particules magnétiques pour précipiter les billes à chaque étape.
- Aspirez le tampon des billes et ajoutez 100 μl 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM de NaCl, 0,1 mM de DTT et 4 mM d’EDTA.
- Selon que le GDP, le GTP ou l'absence de charge nucléotidique est nécessaire pour l'expérience de compétition, ajoutez 12 μl 100 mM de GDP, 12 μl 10 mM de guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate (GTPγS) ou aucun nucléotide à 60 μl de billes GST-Rac1.
- Pour les contrôles de charge nucléotidique, divisez les billes restantes en trois aliquotes de 10 μl et ajoutez 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS ou aucun nucléotide dans chaque tube.
- Incuber les mélanges de billes pendant 30 min à 30 °C avec agitation.
- Stabiliser Rac1 lié aux nucléotides en ajoutant 1 M MgCl2:3 μl au mélange expérimental (étape 4.4) et 0,5 μl à chacun des mélanges témoins (étape 4.5).
5. Fixation de compétition
- Installez 6 tubes de microfuge, chacun contenant :
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl de billes Rac1 expérimentales chargées de nucléotides (à partir de l’étape 4.7)
5 μl de protéine A de liaison Rac1 (protéine de liaison constante)
- Dans chaque tube, ajoutez 0, 1, 2,5, 5, 10 ou 20 μl de protéine B de liaison Rac1 (protéine de liaison variable). Ces volumes supposent des concentrations de stock à peu près égales de protéines de liaison constantes et variables et peuvent devoir être ajustés.
- Ajustez les volumes des protéines de liaison A et B s’il existe de grandes différences dans les affinités de liaison des deux protéines, ce qui devrait être déterminé empiriquement par les répétitions expérimentales. Porter le volume total du mélange de liaison à 235 μl par l’ajout de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) et de 20 mM de MgCl2.
- Mettre en place un tube de microfuge contenant :
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl de billes Rac1 expérimentales chargées de nucléotides (à partir de l’étape 4.7)
10 μl de protéine A de liaison Rac1 (protéine de liaison constante)
- Configurer les tubes de contrôle GDP, GTPγS et sans nucléotide :
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
Perles de contrôle Rac1 de 10 μl chargées à l’étape 4.5 avec GDP, GTPγS ou sans nucléotide et stabilisées à l’étape 4.7.
180 μl HEK293T de lysat GFP-TrioD1, préparé comme à l’étape 3.6
4 μl 1 M MgCl2
- Incuber le mélange pendant 2 heures en mélangeant par inversion à 4 °C.
- Lavez les billes trois fois avec 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) et 20 mM de MgCl2.
- Protéines liées à l’élution dans un tampon d’échantillon réducteur de 20 μl (50 mM de Tris-HCl (pH 7), 5 % SDS, 20 % de glycérol, 0,02 mg/ml de bleu de bromophénol, 5 % de β-mercaptoéthanol).