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1. Produire des microréseaux d’antigènes grippaux
- Imprimer des antigènes sur des lames de microréseaux
- Reconstituer chaque antigène lyophilisé à une concentration de 0,1 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 0,001 % de Tween-20 (T-PBS). Transférer 10 μL de chaque antigène reconstitué dans les puits individuels d’une plaque à fond plat non traitée de 384 puits.
- Imprimez des antigènes à l’aide d’une imprimante à microréseaux dotée de broches de détection à faible volume qui aspirent l’antigène dans le canal d’échantillonnage et le déposent par contact direct et par capillarité sur des lames de verre recouvertes de nitrocellulose à 16 tampons.
- Programmez le logiciel d’impression (par exemple, Gridder) avec la configuration de la plaque source et les paramètres d’impression.
- Utilisez le menu déroulant pour sélectionner le nom du type de plaque qui sera utilisé avec cette méthode d’impression. Pour cette étude, utilisez une plaque à fond plat non traitée de 384 puits.
- Sélectionnez la zone de texte en regard de Number of Plates (Nombre de plaques) et saisissez le nombre de plaques d’échantillon qui seront utilisées dans ce protocole d’impression. Pour cette étude, utilisez 1 assiette.
- Sélectionnez une configuration de broche à utiliser avec cette méthode. Pour cette étude, utilisez une configuration à 8 broches.
- Assurez-vous que les décalages d’origine sont les distances (dans les directions X et Y) entre l’origine de la diapositive (qui est calibrée dans la section Administratif) et l’emplacement où les broches d’impression commenceront à être imprimées sur les diapositives.
- À l’aide de l’onglet Création de réseau, définissez la taille et la forme des tableaux (espacement des points et nombre de points par sous-réseau). Pour cette étude, imprimez 324 spots (180 μm de diamètre avec un espacement de 300 μm) sur des diapositives de 16 pads au format 18x18 à l’aide de 8 broches.
- Sélectionnez les paramètres de collecte et de distribution des échantillons par les broches d’impression. Pour cette étude, chaque broche aspire 250 nL de solution d’antigène et imprime 1 nL sur chacun des 40 points (total de 20 lames pour les 8 broches)
- Configurez le protocole de nettoyage des broches et le protocole de transfert. Pour cette étude, chaque broche imprime l’antigène, est trempé dans du ddH2O stérile dans un récipient de lavage soniqué, puis aspire l’antigène suivant.
- Définissez l’ordre dans lequel les blocs d’échantillonnage sont imprimés sur les lames. Le logiciel de réseau construira un fichier d’index de grille annoté (.gal) pour décrire l’arrangement des antigènes dans chaque microarray.
note: La rangée supérieure est utilisée pour les repères (avec une fluorescence à toutes les longueurs d’onde utilisées en imagerie, par exemple, un mélange de conjugué de streptavidine Qdot 585 nm et de conjugué de streptavidine Qdot 800 nm dans cette étude) pour orienter les grilles pendant l’imagerie. Pour les longs tirages d’impression, les antigènes de la plaque source peuvent être périodiquement remis en suspension par pipetage de haut en bas, puis de centrifugation, ou une nouvelle plaque source peut être préparée et utilisée.
- Placez les lames de microréseaux non sondées dans une boîte étanche à la lumière et conservez-les dans une armoire à dessiccateur à température ambiante pour un stockage à long terme.
note: Le protocole peut être suspendu indéfiniment à ce stade.
- Effectuer un contrôle de qualité (nécessite des étiquettes poly-histidines)
- Fixez la lame aux chambres de sondage et réhydratez-la avec un tampon de blocage comme décrit aux étapes 2.1.1-2.1.2 et illustré à la figure 1.
- Diluer l’anticorps poly-His monoclonal de souris 1:100 dans un tampon de blocage 1x filtré.
note: Si des antigènes protéiques non purifiés (p. ex., exprimés dans le système de transcription et de traduction in vitro) sont directement utilisés pour imprimer des microréseaux, ajouter des composants du système d’expression protéique (p. ex., le lysat d’E. coli) dans un rapport de 1:10 avec le tampon de blocage utilisé pour la dilution sérique afin de bloquer les anticorps dirigés contre ces composants.
- Ajouter 100 μL d’anticorps poly-His dilués dans chaque chambre de lame contenant le tampon de matrice après l’aspiration et incuber pendant 2 h à température ambiante ou toute une nuit à 4 °C sur un agitateur. Lavez 3 fois avec le tampon T-TBS comme décrit à l’étape 2.2.1. Diluez l’anticorps secondaire IgG de chèvre anti-souris conjugué à la biotine 1:200 dans un tampon de blocage, ajoutez 100 μL par puits après l’aspiration et incubez pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur. Laver 3 fois avec le tampon T-TBS.
- Diluez le conjugué de streptavidine Qdot 585 nm à 4 nM dans un tampon de blocage, ajoutez 100 μL par puits après l’aspiration et incubez pendant 1 h à température ambiante sur l’agitateur. Laver 3 fois avec le tampon T-TBS, puis une fois avec le tampon TBS (sans Tween).
- Démontez et quantifiez les lames comme décrit aux étapes 2.2.5 à 3.1.2.
note: Les antigènes protéiques doivent contenir des marqueurs His10 pour utiliser ce protocole de contrôle de la qualité. Alternativement, si une étiquette différente est incluse, un contrôle de qualité peut être effectué avec un anticorps ou un ligand pour cette étiquette.
2. Sonder les sérums pour les anticorps antigrippaux à l’aide de microréseaux
- Incuber des sérums sur des microréseaux pour la liaison des anticorps.
- Fixez les lames de microréseaux aux chambres à l’aide de clips et placez-les dans des cadres comme illustré à la Figure 2.
note: Évitez toujours de toucher le tampon de la puce avec les mains et les instruments. Assurez-vous que les glissières sont orientées avec le coussin vers le haut et la petite encoche dans le coin supérieur droit.
- Réhydratez les lames de microréseaux avec 100 μL par puits de tampon de blocage 1x filtré, et diluez le sérum 1:100 dans 100 μL de tampon de blocage (vous pouvez utiliser des plaques de 96 puits non traitées ou des tubes de 2 ml). Incuber séparément les lames de microréseaux réhydratées dans des cadres couverts et le sérum dilué pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital à 100-250 tr/min. Effectuez toutes les étapes d’incubation suivantes de la même manière sur le shaker.
note: Les sérums doivent être aliquotes et congelées à -80 °C pour un entreposage à long terme afin de minimiser les cycles de gel-dégel, et doivent être mélangées à un vortex et centrifugées pour éliminer les particules avant utilisation. Observez attentivement les chambres à lames pendant et après cette étape pour détecter toute fuite nécessitant un remontage des chambres à lames.
- À l’aide des pointes de pipette reliées à une conduite de vide avec une fiole de collecte secondaire, aspirez soigneusement le tampon de blocage du coin de chaque chambre sans toucher les tampons. Effectuez toutes les étapes d’aspiration ultérieures de la même manière. Ajoutez du sérum dilué aux tampons rapidement après l’aspiration afin de ne pas laisser les tampons sécher.
- Placez les cadres couverts dans des plateaux à l’intérieur d’un récipient secondaire entouré d’essuie-tout humide et scellé pour éviter l’évaporation. Incuber toute la nuit à 4 °C sur un agitateur à bascule (ou peut incuber pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur orbital à 100-250 tr/min).
- Anticorps sériques liés au marquage avec des anticorps secondaires conjugués à des points quantiques
- Aspirez soigneusement les sérums des chambres comme décrit ci-dessus, ajoutez 100 μL par puits de tampon T-TBS (20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,05 % de Tween-20 dans ddH 2 O ajusté à pH7,5et filtré, peut être obtenu dans le commerce), et incubez pendant 5 min sur un agitateur orbital à 100-250 tr/min. Répétez cette étape de lavage 3 fois au total (toutes les étapes de lavage suivantes sont effectuées de la même manière).
- Préparez un mélange d’anticorps secondaires dilués à 1 μM dans un tampon de blocage et mélangez soigneusement par pipetage avant et pendant l’utilisation pour maintenir l’homogénéité.
note: Pour maintenir la reproductibilité des essais, le même lot de chaque anticorps secondaire doit être utilisé pour toutes les expériences de sondage pour lesquelles une comparaison quantitative des données entre les expériences est prévue. Il peut être nécessaire de varier la concentration spécifique de l’anticorps secondaire en fonction de l’affinité ; Suivez les protocoles du fabricant lorsque cela est possible.
- Aspirez le tampon des chambres après le lavage final, ajoutez 100 μL par puits de mélange d’anticorps secondaires et incubez pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur.
- Aspirer le mélange d’anticorps secondaires laver 3 fois avec le tampon T-TBS, puis laver une fois avec le tampon TBS (sans Tween).
- Retirez soigneusement les lames de microréseaux des chambres pour éviter de les toucher, rincez-les doucement avec du ddH2O filtré et séchez-les en les plaçant dans des tubes de 50 mL et en les centrifugeant à 500 x g pendant 10 min.
- Placez les lames de microréseaux sondées dans une boîte à l’épreuve de la lumière et conservez-les dans une armoire à dessiccateur à température ambiante pour un stockage à long terme.
note: Le protocole peut être interrompu jusqu’à 1 semaine à ce stade.
3. Quantifier la liaison des anticorps aux antigènes dans les microréseaux
- Visualisez les lames de microréseaux et quantifiez l’intensité de la fluorescence du spot pour mesurer la liaison des anticorps.
- Acquérez des images de lames de microréseaux à l’aide de l’imageur portable doté d’un logiciel intégré.
- Dans l’onglet Configurer l’imageur, sélectionnez la configuration de diapositive appropriée. Pour cette étude, utilisez des diapositives de 16 pads.
- Dans l’onglet Contrôle de l’image, sélectionnez le canal fluorescent approprié et ajustez le gain, le temps d’exposition et le temps d’acquisition en fonction de la réactivité du sérum pour obtenir des images optimales. Pour cette étude, les canaux fluorescents pour les IgA et les IgG étaient respectivement de 585 nm et 800 nm, et les paramètres d’imagerie étaient de gain de 50, de temps d’exposition de 500 ms et de temps d’acquisition de 1 s.
- Cliquez sur Capturer pour lancer le processus d’acquisition de l’image.
note: Les lames de microréseaux peuvent être réimagées à plusieurs niveaux sans dégradation des signaux, tant qu’elles sont stockées dans l’obscurité et au sec. D’autres systèmes d’imagerie peuvent être utilisés s’ils sont compatibles avec les lames.
- Détectez les points du réseau à l’aide de grilles orientées en fonction des marqueurs repères et mesurez l’intensité du point comme la médiane de l’intensité du pixel moins l’arrière-plan mesuré autour des points. Exécutez cet algorithme de quantification par lots à l’aide du logiciel d’imagerie intégré, qui utilise le fichier .gal construit à l’étape 1.1.2 pour relier les intensités ponctuelles aux antigènes individuels sur chaque microréseau.
- Dans le panneau Informations sur le fichier, téléchargez le fichier .gal en le sélectionnant dans son dossier sur l’ordinateur, puis spécifiez le dossier dans lequel les fichiers de sortie d’analyse doivent être enregistrés dans la section Options d’analyse.
- Dans l’onglet Contrôle d’image, ouvrez l’une des images acquises à quantifier et sélectionnez le bouton Auto dans le coin supérieur droit.
- Dans la section Analyse de réseau dans le coin inférieur droit, créez un modèle de repère comme indiqué par le logiciel.
- Cliquez sur l’analyse par lots, sélectionnez le dossier qui contient les images à quantifier, puis sélectionnez le modèle de repère créé à l’étape précédente. Le logiciel analyse chaque image et quantifie l’intensité du spot.
note: Cette étape générera un fichier .csv contenant des intensités ponctuelles quantifiant les anticorps dans chaque échantillon sérique qui se lient à chaque antigène individuel sur la puce à ADN qui peut ensuite être manipulé dans un tableur ou un logiciel d’analyse.
- Analysez les données brutes pour comparer la liaison des anticorps entre les antigènes et les échantillons de sérum. Pour cette étude, les anticorps IgA et IgG mesurés à des intensités de points fluorescents de 585 nm et 800 nm ont été comparés pour tous les antigènes entre 2 exécutions indépendantes de l’expérience utilisant différentes lames à des jours différents, et une analyse de corrélation a été effectuée pour mesurer la reproductibilité du test.
note: Pour les protéines non purifiées imprimées sous forme de mélange d’expression, l’analyse des données doit commencer par une soustraction de fond de l’absence de contrôle de l’ADN.
