Microscopie TIRF pour visualiser la dynamique du couplage de l’actine et des microtubules

Résumé

Source : Henty-Ridilla, J.L., Visualisation de la dynamique du couplage des actines et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF). J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo décrit TIRF, une technique basée sur la microscopie à réflexion interne totale pour visualiser la dynamique de polymérisation de l’actine et des microtubules. La méthode permet l’imagerie à haute résolution de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules en temps réel, ce qui est essentiel pour comprendre les interactions cellulaires.

Protocole

1. Lavage des lamelles

REMARQUE : Laver les lamelles (24 mm x 60 mm, #1.5) selon Smith et al., 2013.

1. Disposez les lamelles dans un contenant d’enveloppe en plastique.
2. Immerger successivement les lamelles dans les solutions suivantes et sonicer pendant 30 à 60 min, en rinçant avec du ddH₂O 10 fois entre chaque solution : ddH₂O avec une goutte de savon à vaisselle ; 0,1 M KOH. Conservez les lamelles dans de l’éthanol à 100 % jusqu’à 6 mois.
   note: Ne touchez pas les surfaces en verre avec des doigts non gantés. Utilisez plutôt des forceps.

2. Revêtement nettoyé (24 mm x 60 mm, #1.5) lamelles avec mPEG- et biotine-PEG-silane

REMARQUE : Ce protocole utilise spécifiquement un système biotine-streptavidine pour positionner l’actine et les microtubules dans le plan d’imagerie TIRF. D’autres revêtements et systèmes peuvent être utilisés (par exemple, anticorps, poly-L-lysine, myosine NEM, etc.).

1. Décongeler des aliquotes de poudres de PEG-silane et de biotine-PEG-silane.
2. Dissoudre les poudres de PEG dans de l’éthanol à 80 % (pH 2,0) pour générer des solutions mères d’enrobage de 10 mg/mL de mPEG-silane et de 2-4 mg/mL de biotine-PEG-silane, juste avant l’utilisation.
   note: Les poudres de PEG semblent souvent dissoutes, mais peuvent ne pas l’être au niveau microscopique. La remise en suspension correcte prend ~1-2 min avec un pipetage constant. Les utilisateurs sont encouragés à pipeter 10 fois de plus après l’apparition de la dissolution de la poudre.
   prudence: Portez des gants pour protéger la peau du HCl concentré lors de la fabrication d’éthanol à 80 % (pH 2,0).
3. Retirez la lamelle propre (24 mm x 60 mm, #1.5) du stockage de l’éthanol à l’aide d’une pince. Sécher avec de l’azote gazeux et conserver dans une boîte de Pétri propre.
4. Enduire les lamelles avec 100 μL de solution d’enrobage : un mélange de 2 mg/mL de mPEG-silane (MW 2 000) et de 0,04 mg/mL de biotine-PEG-silane (MW 3 400) dans de l’éthanol à 80 % (pH 2,0).
   note: Pour un enrobage clairsemé (recommandé), utiliser 2 mg/mL de mPEG-silane et 0,04 mg/mL de biotine-PEG-silane. Pour un enrobage dense, utilisez 2 mg/mL de mPEG-silane, 4 mg/mL de biotine-PEG-silane.
5. Incuber les lamelles à 70 °C pendant au moins 18 h ou jusqu’à utilisation.
   note: Les lamelles enrobées se dégradent si elles sont stockées à 70 °C pendant plus de 2 semaines.

3. Assemblage des chambres d’écoulement d’imagerie

1. Coupez 12 bandes de ruban adhésif double face à dos double sur une longueur de 24 mm. Retirez un côté du support du ruban et fixez des morceaux de ruban à côté des six rainures présentes sur une chambre d’imagerie propre.
   note: Le ruban doit être plat pour un assemblage correct, sinon les chambres d’imagerie fuiront. Retirez soigneusement le support du ruban adhésif pour éviter les chocs. Il est recommandé de faire glisser les chambres scellées sur une surface propre pour lisser les contacts entre la chambre de la bande et la bande.
2. Retirez le deuxième morceau de support de ruban adhésif pour exposer le côté collant du ruban le long de chaque rainure de la chambre. Placez le ruban adhésif de chambre vers le haut sur une surface propre.
3. Mélangez des solutions de résine époxy et de durcisseur 1:1 (ou selon les instructions du fabricant) dans un petit bateau de pesée.
4. À l’aide d’une pointe P1000, placez une goutte d’époxy mélangé entre les bandes de ruban à l’extrémité de chaque rainure de la chambre d’imagerie (flèche rouge ; Figure 1A). Placez le ruban adhésif de chambre/côté époxy vers le haut sur une surface propre.
5. Retirez une lamelle enrobée de l’incubateur à 70 °C. Rincez six fois les surfaces revêtues et non revêtues des lamelles avec du ddH₂O, séchez-les avec de l’azote gazeux filtré, puis fixez-les dans la chambre d’imagerie avec le côté revêtement de lamelles vers le ruban.
6. Utilisez une pointe de pipette P200 ou P1000 pour appliquer une pression sur l’interface ruban-verre afin d’assurer une bonne étanchéité entre le ruban et la lamelle.
   note: Avec une bonne étanchéité, le ruban adhésif double face devient translucide. Les chambres d’imagerie ne disposant pas d’un nombre suffisant de contacts de chambre de bande fuient.
7. Incuber les chambres assemblées à température ambiante pendant au moins 5 à 10 minutes pour permettre à l’époxy de sceller complètement les puits de la chambre avant utilisation. Les chambres de perfusion expirent dans les 12 à 18 heures suivant l’assemblage.
   note: En fonction de l’emplacement du ruban et de l’épaisseur du ruban double face utilisé, la chambre assemblée aura un volume final de 20 à 50 μL.

4. Conditionnement des chambres de perfusion

1. À l’aide d’une pompe à perfusion (débit réglé à 500 μL/min), procéder à l’échange séquentiel des solutions de conditionnement dans la chambre de perfusion comme suit :
   1. Écoulez 50 μL de BSA à 1 % pour amorcer la chambre d’imagerie. Retirez l’excès de tampon du réservoir de raccord Luer-lock.
   2. Débit 50 μL de streptavidine à 0,005 mg/mL. Incuber pendant 1 à 2 min à température ambiante. Retirez l’excédent de tampon du réservoir.
   3. Débit 50 μL de BSA à 1 % pour bloquer la liaison non spécifique. Incuber pendant 10 à 30 s. Retirez l’excédent de tampon du réservoir.
   4. Débit 50 μL de méthylcellulose tiède (37 °C) 1x tampon TIRF (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM de glucose, 0,25 % (v/v) méthylcellulose (4 000 cp)).
      note: Ne retirez pas l’excès de tampon du réservoir. Cela empêche la chambre de se dessécher, ce qui peut introduire des bulles d’air dans le système.
   5. Facultatif : Débit de 50 μL de graines de microtubules stabilisées et biotinylées à 50 % diluées dans 1x tampon TIRF.
      note: La dilution appropriée doit être déterminée empiriquement et contenir la variabilité d’un lot à l’autre. Une dilution produisant 10 à 30 graines par champ de vision fonctionne bien avec cette configuration.

5. Préparation du microscope

REMARQUE : Les réactions biochimiques contenant des filaments d’actine dynamiques et des microtubules sont visualisées/réalisées à l’aide d’un microscope à fluorescence interne totale inversée (TIRF) équipé de lasers à semi-conducteurs de 120 à 150 mW, d’un objectif TIRF à immersion dans l’huile 63x corrigé en température et d’une caméra EMCCD. Les protéines de cet exemple sont visualisées aux longueurs d’onde suivantes : 488 nm (microtubules) et 647 nm (actine).

1. Réglez l’appareil de chauffage de la platine/de l’objectif pour qu’il maintienne 35-37 °C au moins 30 minutes avant d’imager la première réaction biochimique.
2. Définissez les paramètres d’acquisition d’image comme suit :
   1. Réglez l’intervalle d’acquisition sur toutes les 5 s pendant 15 à 20 minutes.
   2. Réglez les expositions laser 488 et 647 sur 50-100 ms à une puissance de 5 à 10 %. Réglez l’angle TIRF approprié pour le microscope.
      note: Quelle que soit la configuration du microscope, la façon la plus simple de régler la puissance du laser, l’exposition et l’angle TIRF est d’effectuer des ajustements sur des images de l’un ou l’autre polymère seul (voir 5.2.2.1 et 5.2.2.2, ci-dessous). Les utilisateurs sont fortement encouragés à utiliser la puissance laser et les paramètres d’exposition les plus bas qui permettent toujours la détection.
      1. Ajustez la réaction de polymérisation (Figure 1C) pour initier l’assemblage des filaments d’actine et acquérez des images à 647 nm. Faites les ajustements appropriés.
      2. Ajustez la réaction de polymérisation dans un deuxième puits de perfusion conditionné pour initier l’assemblage des microtubules (Figure 1C) et visualisez à 488 nm. Faites les ajustements appropriés.

6. Préparation des mélanges de réaction protéique

1. Préparez une solution mère de tubuline marquée par fluorescence.
   1. Déterminer la concentration de tubuline non marquée faite maison par spectrophotométrie à Abs₂₈₀, comme suit :
      1. Spectrophotomètre à blanc avec 1xBRB80 sans GTP.
      2. Calculer la concentration de tubuline à l’aide du coefficient d’extinction déterminé de 115 000 M^‐1 cm^‐1 et de la formule suivante :
         7. Image, actine et dynamique des microtubules
         1. Conditionnez bien la perfusion (Figure 1B ; étape 4, ci-dessus).
         2. Amorcez l’assemblage simultané de l’actine et des microtubules en ajoutant le contenu du tube B (mélange réactionnel) au tube A (mélange de cytosquelette) (figure 1C).
         3. Écoulement de 50 μL de la réaction contenant 1 tampon TIRF complété par de la tubuline libre de 15 μM, 1 mM de GTP et des monomères d’actine de 0,5 μM et des volumes appropriés de témoins de tampon.
         4. Enregistrez des vidéos en accéléré à l’aide d’un logiciel de microscope pour les acquérir toutes les 5 s pendant 15 à 20 min
            note: L’initiation de la dynamique de l’actine et des microtubules se produit en 2 à 5 minutes (Figure 2). Des délais plus longs indiquent des problèmes de contrôle de la température ou des problèmes liés à la concentration des protéines dans le mélange réactionnel.
         5. Conditionnez un nouveau puits de perfusion (étape 4) et remplacez le volume tampon par une ou plusieurs protéines régulatrices d’intérêt (c.-à-d. Tau) et des témoins tampons (figure 1C). Acquérir comme indiqué à l’étape 7 (ci-dessus) pour évaluer les protéines régulatrices des fonctions émergentes des microtubules d’actine.

Résultats

Graphique 1. Schémas expérimentaux : assemblage de la chambre d’écoulement jusqu’à l’acquisition d’images. (A) Assemblage de la chambre d’imagerie. De haut en bas : Les chambres d’imagerie IBIDI sont collées le long des puits de perfusion (indiqués par une flèche) ; la deuxième couche (blanche) de support de ruban adhésif (laissée sur l’image montrée pour mieux orienter les utilisateurs) est retirée et de l’é...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 % BSA (p/v)	Fisher Scientific	BP1600-100	À cette fin (blocage des chambres TIRF), le BSA est remis en suspension dans ddH20 et filtré à travers un filtre de 0,22 μm.
1× BRB80	fait maison		TUYAUX 80 mM, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 avec KOH
TUYAUX 80 mM, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 avec KOH	Sigma Aldrich Inc., Saint-Louis, Missouri	G2133-50KU	Combiné avec la catalase, l’aliquote et le stockage à -80 oC jusqu’à l’utilisation
Tubuline 100 μM	Cytoskeleton Inc, Denver, CO	T240	Les tubulines faites maison doivent être recyclées avant d’être utilisées pour éliminer les tubulines inaptes à la polymérisation (Hyman et al. (1992)29 ; Li et Moore (2020)30 ). Les tubulines disponibles dans le commerce sont souvent trop diluées pour être recyclées, mais fonctionnent bien si elles sont remises en suspension conformément aux instructions du fabricant et pré-éliminées par ultracentrifugation (278 000 × g) pendant 60 min, avant utilisation.
100 mM d’ATP	Gold Biotechnology Inc., Olivette, Missouri	A-08	Remise en suspension dans ddH20 (pH 7,5) et filtre stérilisé.
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	Remis en suspension dans 1× BRB80 (pH 6,8) et stérilisé par filtre.
Lasers à semi-conducteurs 120-150 mW	Microsystèmes Leica	11889151 ; 11889148
2 mg/mL de catalase	Sigma Aldrich Inc., Saint-Louis, Missouri	Réf. C40-100	Combiné avec la glucose oxydase, aliquote et conserver à -80 oC jusqu’à l’utilisation
2× Zone tampon TIRF	Fou d’accueil		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM de glucose, 0,5 % (v/v) de méthylcellulose (4 000 cp) ; Remarque : 1 μL de 0,1 M GTP et 1 μL d’ATP 0,1 M ajoutés séparément aux réactions TIRF pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
24 × 60 mm, verre de protection #1.5	Fisher Scientific, Waltham, MA	Référence 22-266882	Le verre de protection doit être lavé abondamment avant d’être utilisé (Smith et al. (2014)22 )
Bloc chauffant 37 oC
Bain-marie à 37 oC
5 mg/mL de streptavidine (600x stock)	Avantor, Philadelphie, Pennsylvanie	RLS000-01	Remise en suspension dans du Tris-HCl (pH 8,8) ; diluer l’aliquote à 1× dans un tampon HEK le jour de l’utilisation
5 min Résine époxy et durcisseur	Loctite, Rocky Hill, CT	1365736	Le durcissement combiné de la résine et du durcisseur peut prendre jusqu’à 30 minutes.
50 % de graines de microtubules biotinylées-GpCpp	Cytosquelette Inc ; Fait maison	T333P	(facultatif) Les graines de microtubules stabilisées au GppCpp ou au Taxol peuvent faciliter plus efficacement la polymérisation des microtubules. Le Taxol et le GppCpp stabilisent les microtubules de différentes manières, ce qui peut affecter la structure du réseau des microtubules et la capacité de certaines protéines régulatrices à se lier à la partie stabilisée du microtubule. Hyman et al. (1992) décrivent une méthode pour fabriquer divers types de graines de microtubules.
Incubateur 70 C
Mélange d’actine	Fait maison, ce protocole		Un mélange d’actine de 12,5 μM composé d’actine marquée (fluorescente et biotinylée) et d’actine non marquée pour un maximum de six réactions. 2 μL de stock sont utilisés dans la réaction finale de TIRF. La concentration finale d’actine utilisée dans chaque réaction est de 0,5 μM (10 % Alexa-647 ; 0,09 % marqué à la biotine).
Contrôles de tampon appropriés	fait maison		Combinaison de tampons de toutes les protéines évaluées
Biotine-PEG-silane (MW 3 400)	Laysan Bio Inc	biotine-PEG-SIL-3400	Distribué en aliquotes de 2 à 5 mg, remblayé avec de l’azote, parafilmé fermé et stocké à -20 °C avec un dessiccant jusqu’à l’utilisation
Actine biotinylée	Cytosquelette Inc ; Fait maison	AB07	La biotine-actine est fabriquée par marquage sur des résidus de lysine et est donc supposée être marquée à au moins 100 %, mais varie selon les différents lots/préparations. Les concentrations optimales d’actine biotinylée doivent être déterminées empiriquement pour des utilisations ou des plans d’expérience particuliers. Des concentrations plus élevées permettent un suivi plus efficace, mais peuvent entraver la polymérisation ou les interactions avec les protéines régulatrices. Ici, un petit pourcentage (0,09 % ou 900 pM) d’actine biotinylée est présent dans la réaction finale TIRF.
Savon à vaisselle	Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		Pour des raisons inconnues, la version bleue nettoie les lamelles plus efficacement que les autres couleurs disponibles.
neige carbonique
Actine marquée par fluorescence	Cytosquelette Inc ; Fait maison	AR05	L’actine faite maison marquée par fluorescence est stockée dans un tampon G complété par 50 % de glycérol à -20 °C (Spudich et al. (1971) 47 ; Liu et al. (2022)48 ). L’actine marquée par fluorescence est dialysée contre le tampon G et pré-éliminée par ultracentrifugation pendant 60 min à 278 000 × g avant utilisation.
Tubuline marquée par fluorescence	Cytosquelette Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	Ré-en suspension dans 20 μL 1× BRB80 (concentration finale de 10 μM) et pré-dégagé par ultracentrifugation (278 000 × g) pendant 60 min, avant utilisation.
G-buffer	fait maison		3 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM de CaCl2, 0,5 mM de DTT, 0,2 mM d’ATP
Tampon HEK	fait maison		20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
glace
Seau à glace
Chambre d’imagerie	IBIDI, Fitchburg, WI	Référence 80666	Commandez des chambres sans fond pour utiliser différents revêtements de lamelles
Caméra iXon Life 897 EMCCD	Andor, Belfast, Irlande du Nord	8114137
Logiciel de microscope LASX Premium	Microsystèmes Leica	8114137
Méthylcellulose (4 000 cp)	Sigma Aldrich Inc	M0512
Base de microscope équipée d’un module TIRF	Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne	11889146
mPEG-silane (MW 2 000)