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1. Réalisation de l’alignement quotidien LLSM
REMARQUE : (Important) Ce protocole d’alignement est basé sur l’instrument LLSM utilisé (voir le Tableau des matériaux). Chaque LLSM peut être différent et nécessiter des stratégies d’alignement différentes, en particulier celles qui sont faites maison. Effectuez l’alignement de routine approprié et passez à la section 2.
- Ajoutez 10 ml d’eau et 30 μL de fluorescéine (1 mg/mL de stock) dans le bain LLSM (volume de ~10 mL), appuyez sur Image (Accueil) pour déplacer l’objectif à la position de l’image, et regardez un seul faisceau laser de Bessel. Alignez le faisceau laser à l’aide des guides et de la région d’intérêt (ROI) prédéfinie pour faire du faisceau un motif mince équilibré dans toutes les directions.
- Le faisceau doit également apparaître focalisé dans l’appareil photo du viseur. Utilisez deux dispositifs de réglage de l’inclinaison du miroir, un micromètre supérieur, une mise au point et un collier d’objectif d’émission pour ajuster. Voir les figures 1 A et B pour le faisceau correctement aligné.
- Lavez le bain et les objectifs avec au moins 200 ml d’eau pour éliminer complètement la fluorescéine.
- Imagez des billes fluorescentes standard dans le support d’imagerie (préparées en collant des billes sur une lamelle de 5 mm avec de la poly-L-lysine, voir le tableau des matériaux ; cela peut être pré-préparé et réutilisé) pour la fonction d’étalement du point physique (PSF) dans le support d’imagerie.
REMARQUE : Il ne peut y avoir qu’une seule perle en vue pour un traitement ultérieur, alors essayez de trouver une perle qui se trouve seule dans la visionneuse ou qui peut facilement être recadrée pour obtenir une seule perle.
- Activez le tramage en le réglant sur 3 dans la zone « Plage X Galvo ». Appuyez sur Live pour afficher le champ actuel. Déplacez-vous le long de la direction Z pour trouver la lamelle et les perles. Trouvez le centre d’une perle en vous déplaçant le long de Z, appuyez sur Stop pour mettre le laser en pause. Vérifiez 3D, appuyez sur Centre, puis appuyez sur Exécuter. Celui-ci collectera les données.
- Ajustez manuellement le miroir inclinable, le collier d’objectif et le micromètre de mise au point pour obtenir les valeurs de gris les plus élevées, puis ajustez si nécessaire pour obtenir les motifs appropriés pour les modes de capture de balayage objectif, z galvo, z + objectif (totPSF) et balayage d’échantillon (samplePSF). Voir la figure 1 C-F pour les projections d’intensité maximale (MIP) correctement ajustées.
note: Les différents modes de capture (balayage objectif, galvo z, objectif z + et balayage de l’échantillon) modifient la façon dont la feuille de lumière se déplace dans l’échantillon. Tous les modes de balayage doivent être utilisés pour l’alignement.
- Le balayage de l’échantillon montre comment les données seront collectées au cours de l’expérience. Collectez l’échantillon PSF en appuyant sur Exécuter en mode de balayage d’échantillon pour le redressement et la déconvolution. Changez les lasers en trois modes de couleur (488, 560, 647) et appuyez à nouveau sur Exécuter.
note: Comme les images LLSM sont inclinées (57,2°), les images capturées en mode « balayage d’échantillon » sont collectées à cet angle et sont donc « asymétriques ». Le décalibrage est le processus de correction de cet angle et de « réalignement » de l’image sur une véritable pile z. Ces données doivent être collectées dans les supports d’imagerie et dans tous les canaux qui seront imagés au cours de l’expérience. Si elles ne sont pas collectées correctement, les données ne seront pas correctement défaussées. De même, assurez-vous que le média a été chauffé à 37 °C (ou à la température expérimentale souhaitée).
2. Configuration des cellules avec LLSM
- Ajoutez 100 000 cellules présentatrices d’antigène (CPA) (50 μL) dans une lamelle circulaire de 5 mm de diamètre et laissez-les reposer pendant 10 min.
- Graissez le porte-échantillon puis ajoutez-y la lamelle côté cellule vers le haut. Ajoutez une goutte de support d’imagerie à l’arrière de la lamelle pour éviter les bulles avant de la placer dans le bain. Vissez le porte-échantillon sur le piézo et appuyez sur Image (Accueil).
- Trouvez un APC à imager pour vous assurer que le LLSM et le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux) fonctionnent correctement.
note: Nous imaginons à une taille de pas de 0,4 μm avec 60 pas z et une exposition de 10 ms pour deux couleurs avec un tramage défini sur 3, ce qui donne 1,54 s par image de l’image 3D avec une résolution XY de ~200 nm et Z de 400 nm. Il peut être nécessaire d’ajuster ces paramètres en fonction de la taille de la cellule, de la résolution z souhaitée et de l’intensité du signal de la technique de marquage fluorescent utilisée. La consommation d’énergie du laser variera également en fonction de la technique d’étiquetage fluorescente utilisée.
- Appuyez sur Live pour afficher l’image actuelle. Déplacez-vous le long de Z pour trouver la lamelle et les cellules.
- Trouvez le centre d’un APC en vous déplaçant dans la direction Z, puis appuyez sur Stop pour mettre le laser en pause. Vérifiez 3D et entrez les paramètres souhaités, appuyez sur Centre, puis appuyez sur Exécuter. Celui-ci collectera les données.
- Abaissez l’étage en position de charge et ajoutez 50 μL de lymphocytes T dans le milieu d’imagerie (100 000 cellules) directement sur la lamelle. Il est préférable de laisser une goutte se former à l’extrémité de l’embout de la pipette, puis de toucher l’embout au liquide du bain. Soulevez la scène en arrière en cliquant sur « Image (Retour) ».
- Commencez l’imagerie. Assurez-vous de définir la taille de pile et la durée du time-lapse souhaitées. Par exemple, imaginez 60 piles z à une taille de pas de 0,4 μm et entrez 500 images de temps. Arrêtez (généralement) l’enregistrement avant d’atteindre 500 images pour éviter le photoblanchiment. Utilisez le mode Live pour rechercher des paires de cellules, et lorsque les paramètres prêts et souhaités ont été saisis, appuyez sur Exécuter pour collecter des données. Voir la figure 2 pour un exemple.
