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1. Préparation des lames de microscope
NOTE : Les cellules U87 MG de la troisième à la dixième génération à haute activité sont utilisées dans les expériences SPT.
- Stériliser les lamelles de 22 mm × 22 mm déjà nettoyées avec la solution de Piranha en les immergeant dans de l’éthanol (99,9 %).
- À l’aide d’une pince, retirez la lamelle de la solution d’éthanol (étape 1.1) et stérilisez en brûlant de l’éthanol sur la flamme. Une fois que tout l’éthanol est brûlé, placez les lamelles dans une boîte de culture cellulaire en plastique (35 x 10 mm) remplie de 2 mL de milieu cellulaire (sans rouge de phénol).
- Ajoutez 50 μL de suspension cellulaire sur la lamelle et poussez doucement la parabole d’avant en arrière et de gauche à droite pour répartir uniformément les cellules. Placez-le dans une atmosphère humidifiée.
- Lorsque les cellules U87 MG sur la lamelle atteignent une confluence de 20 % à 40 % (~12 h), ajoutez 20 μL de CTAB-AuNRs (nanotiges d’or synthétisées avec une molécule de bromure de cétyltriméthylammonium et d’ammonium comme agent protecteur, 138 pM) dans la boîte et dispersez-les. Incuber dans une atmosphère humidifiée pendant 5 min.
- À l’étape 1.4, ajoutez 100 μL de milieu de culture (sans rouge de phénol) de la boîte dans la rainure de la lame de verre rainurée (figure 1) qui est prénettoyée avec la solution de Piranha.
- Retirez la lamelle de la parabole et retournez-la sur le dessus de la rainure de la lame de verre du microscope (Figure 1). Scellez-le avec du vernis à ongles, laissez-le sécher et placez-le sur la scène pour effectuer des expériences SPT.
2. Réalisation d’expériences de suivi de particules uniques avec la microscopie à fond noir (Figure 1).
- Placez une goutte d’huile sur le condenseur à fond noir immergé dans l’huile (ouverture numérique (NA) 1,43-1,20) et tournez le bouton pour que le condenseur entre en contact avec la lame de verre.
- Déposez une goutte d’huile sur le dessus de la vitre de protection et tournez le bouton de mise au point pour que l’objectif à immersion dans l’huile 60x (NA 0,7 à 1,25) touche l’huile.
- Allumez la source lumineuse et tournez légèrement le bouton de mise au point pour faire la mise au point sur le plan d’image.
note: Dans le champ de vision, l’arrière-plan est noir, les cellules sont lumineuses et les CTAB-AuNRs (rapport d’aspect ~ 2:1, Figure 2) sont de petites taches de diffusion colorées (rouge, jaune ou verte).
- Capturez la lumière de diffusion d’échantillons à l’aide d’une caméra CMOS couleur. Cliquez sur l’icône de l’appareil photo dans le logiciel pour enregistrer et exportez le format TIFF pour enregistrer les images.
3. Acquisition de données
- Extraire une seule trajectoire à long terme
- Procédez comme décrit à la figure 3 pour convertir les images en fond noir de séries chronologiques du mode « couleur RVB » au mode « 8 bits ». Dans l’image J, cliquez sur Image | Type | 8 bits. Pour régler le contraste, cliquez sur Image | Ajuster | Luminosité | Contraste.
- Sélectionnez une particule cible et coupez les arrière-plans de la série chronologique en mettant en boîte et en supprimant l’arrière-plan avec « Ctrl+X ».
- Ouvrez la fenêtre de détection de particules et de liaison de particules en cliquant sur l’icône "Plugins | Traqueur de particules classique | Traqueur de particules".
- Définissez le rayon sur 6, la limite sur 0 et le centile sur 0,01 %.
note: Pour détecter la particule, ajustez les trois paramètres ci-dessus à l’aide de Preview. Assurez-vous que le rayon est légèrement supérieur à celui de la particule ciblée et inférieur à la plus petite séparation entre particules. Le percentile est la limite inférieure de la distribution d’intensité des particules candidates.
- Réglez la portée de liaison sur 5 et le déplacement sur 10.
note: Pour lier la particule entre des images adjacentes consécutives, ajustez les deux paramètres ci-dessus. Le déplacement est le nombre maximal de pixels qu’une particule peut déplacer entre deux images successives, et la plage de liens est le nombre d’images consécutives à prendre en compte pour déterminer la meilleure correspondance correspondante.
- Cliquez sur « OK » pour ouvrir la fenêtre des résultats de ParticleTracker et voir les résultats.
- Cliquez sur « Visualiser toutes les trajectoires » pour inspecter les trajectoires générées.
- Cliquez sur le menu « Relier les particules » en haut pour relier à nouveau les particules détectées avec des plages de liaison et des paramètres de centile différents, si la trajectoire générée par le logiciel ne correspond pas à la trajectoire mobile de l’AuNR.
- Cliquez sur « Enregistrer le rapport complet » pour enregistrer les résultats si la trajectoire générée par le logiciel et la trajectoire mobile de l’AuNR correspondent.
REMARQUE : La figure 4 montre un exemple d’extraction d’une seule trajectoire à long terme avec l’image J.
