Microscopie à réflexion interférentielle pour une visualisation sans marquage de la dynamique des microtubules

Abstract

Source : Mahamdeh, M., et al. Mise en œuvre de la microscopie à réflexion interférentielle pour l’imagerie à grande vitesse sans marquage des microtubules. J. Vis. Exp. (2019).

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de microscopie à réflexion interférentielle (IRM) pour visualiser la croissance des microtubules sur une surface de lamelle en présence d’un tampon approprié. Lors de l’éclairage avec la lumière incidente, l’interface lamelle-tampon et l’interface tampon-microtubule réfléchissent la lumière, qui se combine pour créer un motif d’interférence, permettant la visualisation des microtubules sous forme d’images à contraste élevé sur un fond clair.

Protocol

1. Modification du microscope et lentille de l’objectif

1. Insérez un miroir 50/50 dans la roue à filtres du microscope fluorescent à l’aide d’un cube de filtre approprié (Figure 1). Manipulez le miroir 50/50 avec précaution car il est souvent doté d’un revêtement antireflet.
   note: Nous avons utilisé un miroir 50/50 dans un cube de filtre vide du microscope. Le miroir 50/50 est inséré à l’endroit où se trouve le miroir dichroïque.
2. Utilisez un objectif à huile à fort grossissement et à grande ouverture numérique (NA).
   note: Dans ce protocole, nous avons utilisé un objectif ....

Results

Graphique 1. Représentation schématique de l’IRM. (A) L’épi-éclairage de la source lumineuse passe à travers le diaphragme d’ouverture avant d’atteindre le miroir 50/50. Le diaphragme d’ouverture règle la largeur du faisceau et donc l’éclairage NA. Le miroir 50/50 réfléchit partiellement la lumière jusqu’à l’objectif pour éclairer l’échantillon. La lumière réfléchie par l’échantillon est collectée puis projetée sur la puce de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscope	Nikon	Ti-Eclipse	Un microscope inversé utilisé pour perforer les exprimants
Séparateur de faisceau 50/50	Chroma	21000	Lors de l’achat, assurez-vous de choisir les dimensions du séparateur qui correspondent au cube utilisé dans le microscope
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Objectif Iris	Nikon	MRH02902	Objectif d’imagerie. Cet objectif a un iris d’ajustement NA qui a été ouvert à NA 1.3
Détergent universel Mucasol	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	Utilisé pour le nettoyage des lamelles et des glissières
Film de paraffine plastique (nom commercial Parafilm M)	Sigma-Aldrich	Réf. P7793	Utilisé pour la construction de canaux d’écoulement
Anticorps anti-TAMRA	Invitrogen	A-6397	Utilisé pour lier les molécules marquées par TAMRA (par exemple les microtubules) à la surface de l’échantillon. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (nom commercial Pluronic F-127)	Sigma-Aldrich		Utilisé pour bloquer la surface du canal afin d’éviter les liaisons non spécifiques
Nanoparticules d’or de 40 nm	Sigma-Aldrich	753637	Utilisé comme échantillon de contrôle
Nanoparticules d’or 20 nm	Sigma-Aldrich	Référence 753610	Utilisé comme échantillon de contrôle
Appareil photo Zyla 4.2	Andor	Zyla 4.2	2048x2048 pixels (taille de pixel de 6,5 μm) avec une efficacité quantique de 72 % et une plage dynamique de 16 bits
Logiciel de suivi Feista			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
Microtubules stabilisés			Préparé sur place (voir références dans le texte)