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1. Modification du microscope et lentille de l’objectif
- Insérez un miroir 50/50 dans la roue à filtres du microscope fluorescent à l’aide d’un cube de filtre approprié (Figure 1). Manipulez le miroir 50/50 avec précaution car il est souvent doté d’un revêtement antireflet.
note: Nous avons utilisé un miroir 50/50 dans un cube de filtre vide du microscope. Le miroir 50/50 est inséré à l’endroit où se trouve le miroir dichroïque.
- Utilisez un objectif à huile à fort grossissement et à grande ouverture numérique (NA).
note: Dans ce protocole, nous avons utilisé un objectif 100x/1,3 NA.
2. Préparation de la chambre pour faire adhérer les microtubules à la surface
- Nettoyez les lames de microscope et les lamelles de 22 mm x 22 mm (pour les microscopes droits) ou les lamelles de 22 mm x 22 mm et de 18 mm x 18 mm (pour les microscopes inversés). Modifiez la surface au besoin. Par exemple, nettoyez les lamelles à l’aide d’un détergent alcalin (voir le tableau des matériaux) suivi d’un lavage à 100 % d’éthanol avec de l’eau distillée entre et après.
- Coupez des bandes de film de paraffine plastique de 3 mm de large (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une lame de rasoir et d’une autre lame de microscope comme bord.
- Placez deux bandes de film de paraffine en plastique à 3 mm d’intervalle sur une lamelle propre de 22 x 22 mm. Placez ensuite une lamelle de recouvrement de 18 mm x 18 mm pour former un canal. Si vous utilisez un microscope droit, placez les bandelettes sur une lame de microscope propre, puis placez une lamelle sur le dessus.
- Placez la lamelle (ou la lame) sur un bloc chauffant à 100 °C pendant 10 à 30 s pour que le film de paraffine forme un canal scellé.
- Verser 50 μg/mL d’anticorps (dans le tampon Brinkley 1980 [BRB80]) par perfusion à l’aide d’une pipette. Incuber pendant 10 min
note: Nous utilisons des anticorps anti-rhodamine pour lier les graines de microtubules marquées à la rhodamine à la surface. Alternativement, l’avidine peut être utilisée pour lier les graines de microtubules marquées à la biotine ou aux particules d’or biotinylées. Pour simplement examiner les microtubules en l’absence de tubuline en solution (c’est-à-dire un test non dynamique), un anticorps anti-tubuline peut être utilisé.
- Laver cinq fois avec le tampon BRB80. Il est recommandé de filtrer les solutions à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Coulée dans 1 % de poloxamère 407 (un copolymère tribloc) dans le BRB80 pour bloquer la surface contre la liaison non spécifique. Incuber pendant 10 min.
- Laver cinq fois avec le tampon BRB80.
- L’échantillon est prêt à être placé sur le microscope. Pour éviter que l’échantillon ne se dessèche, ajoutez deux gouttelettes de tampon BRB80 aux extrémités du canal et remplissez-le si nécessaire.
3. Alignement du microscope
- Placez l’échantillon sur la platine du microscope. Allumez la source lumineuse epi-illumination.
- Concentrez-vous sur la surface de l’échantillon. Vous observerez plusieurs surfaces lorsque l’objectif est déplacé de haut en bas en raison de la réflexion arrière de la lumière de l’optique dans le chemin optique. Une bonne méthode pour trouver la surface de l’échantillon consiste à se concentrer sur le bord du film de paraffine. Une fois la surface trouvée, réglez le champ de vision au centre de la chambre.
- Centrez le diaphragme de champ dans le champ de vision en le fermant à mi-chemin et en utilisant les vis de réglage. Une fois aligné, rouvrez le diaphragme.
note: Le réglage de la vis ne doit être effectué que de manière sporadique, peut-être tous les 3 à 6 mois ou lors du dépannage.
- Faites glisser la lentille Bertrand pour voir la pupille de sortie (plan focal arrière) de l’objectif.
- Fermez le diaphragme d’ouverture (AD) au-delà des bords de la pupille de sortie de l’objectif.
- Utilisez les vis de réglage pour centrer l’AD avec la pupille de sortie. Vérifiez en ouvrant l’AD et en faisant correspondre ses bords avec ceux de la pupille de sortie.
note: Cet ajustement ne doit être effectué que de manière sporadique.
- Réglez le diaphragme d’ouverture à environ 2/3 de l’ouverture numérique de l’objectif.
4. Imagerie de microtubules stabilisés ou de particules d’or de 40 nm
REMARQUE : Les microtubules stabilisés et les nanoparticules d’or constituent de bons échantillons de contrôle. Il est recommandé d’imager des microtubules fixés en surface ou des nanoparticules d’or comme première étape pour évaluer les performances IRM et aider à régler l’ouverture optimale du diaphragme (section 7).
- Réglez le temps d’exposition de l’appareil photo sur 10 ms et ajustez l’éclairage pour presque saturer la plage dynamique de l’appareil photo.
- Écoulez 10 μL de microtubules stabilisés au guanylyl-(alpha, bêta)-méthylène-diphosphonate (GMPCCP) ou au taxol dans BRB80 (ou des particules d’or de 40 nm) par perfusion à l’aide d’une pipette vers un échantillon frais et surveillez la liaison en imageant la surface. Une fois que 10 à 20 microtubules sont liés dans le champ de vision, laver l’échantillon 2x avec BRB80.
note: Avec un microscope bien aligné, les microtubules doivent être visibles sans soustraction de fond.
- Acquérez 10 images en réglant un time-lapse avec une période de retard de 1 seconde pendant 10 secondes (à 10 ms d’exposition).
- Acquérir une image d’arrière-plan. Pour ce faire, déplacez la platine à l’aide du contrôleur de platine ou d’un logiciel informatique le long de l’axe du canal tout en acquérant 100 images sans retard (c’est-à-dire en diffusant près de 100 ips @ 10 ms d’exposition).
note: L’arrière-plan est la médiane des 100 images. En prenant le terre-plein, le profil d’éclairage et d’autres caractéristiques stationnaires comme la saleté sur l’optique sont préservés tandis que tout le reste est filtré. Il ne doit pas y avoir d’inclinaison sur l’échantillon, car cela entraînerait un changement de position axiale lorsque l’étage est déplacé et dégraderait finalement l’image d’arrière-plan. Si l’inclinaison ne peut être évitée, une autre méthode consiste à acquérir des images d’arrière-plan moyennées avant de faire couler les graines.
- Pour le traitement et l’analyse des images, passez à l’étape 6.
5. Imagerie de la dynamique des microtubules
- Pour la dynamique des microtubules à l’aide de la tubuline cérébrale, réglez la température du chauffage de l’échantillon à 37 °C.
- Injecter 10 μL de graines de microtubules stabilisées au GMPCCP dans BRB80 par perfusion à l’aide d’une pipette sur un échantillon frais et surveiller leur liaison à la surface en imageant la surface en direct (c.-à-d. pendant l’écoulement). Une fois que 10 à 20 graines sont liées au champ de vision, laver l’échantillon à l’aide d’un volume de canal 2x avec du BRB80 (le BRB80 doit être préchauffé à 37 °C ou au moins à température ambiante).
note: Avec un microscope bien aligné, les graines doivent être visibles sans soustraction de fond.
- Écoulement dans le mélange de polymérisation (tubuline non marquée 7,5 μM + 1 mM de guanosine triphosphate (GTP) + 1 mM de dithiothréitol (DTT) dans un tampon BRB80). Pour mesurer la croissance des microtubules, réglez un time-lapse à l’aide du logiciel d’acquisition pour acquérir une image toutes les 5 secondes (0,2 image par seconde (fps)) pendant 15 minutes.
- Pour améliorer le contraste, acquérez 10 images (au lieu d’une) à chaque point temporel et faites-en la moyenne. Pour le rétrécissement des microtubules, acquérez des images à 100 ips en réglant le retard sur 0 et un temps d’exposition de 10 ms (des fps plus élevés sont possibles avec des zones d’intérêt plus petites en fonction de l’appareil photo utilisé).
- Acquérez une image d’arrière-plan comme à l’étape 4.4.
6. Traitement et analyse d’images
NOTE : Pour l’analyse, ce protocole utilise Fidji, mais le lecteur est libre d’utiliser n’importe quel logiciel qu’il juge approprié.
- Ouvrez les images d’arrière-plan enregistrées.
- Calculez l’image médiane (c’est-à-dire l’arrière-plan) à l’aide du projet Image > Stack > Z > Médiane.
- Ouvrez le film sur la dynamique des microtubules sous forme de pile (idem pour les microtubules non dynamiques) à l’aide de File > Open.
- Soustrayez l’image d’arrière-plan de la pile à l’aide de la calculatrice de > d’image. Assurez-vous de cocher l’option « 32bit (float) result ».
- Pour les microtubules dynamiques, à l’aide de l’outil ligne, tracez une ligne le long du microtubule d’intérêt et ajoutez-la au gestionnaire de région d’intérêt en appuyant sur « t ». Répétez l’opération pour tous les microtubules d’intérêt.
- Pour les microtubules dynamiques, exécutez la macro Multi-Kymo. La macro générera une vidéo et un kymographe pour chaque microtubule dans le gestionnaire de retour sur investissement. Chaque microtubule recevra un identifiant unique.
- Pour les microtubules dynamiques, exécutez la macro Kymo-Analysis et suivez ses étapes pour mesurer les taux de croissance et de retrait des microtubules.
7. Taille du diaphragme d’ouverture
REMARQUE : Un facteur important pour l’acquisition d’images à contraste élevé de microtubules à l’aide de l’IRM est le réglage correct de l’ouverture numérique d’éclairage (INA). L'INA peut être modifié en modifiant la taille du faisceau d'éclairage entrant au niveau de la pupille de sortie de l'objectif, qui est contrôlée par la taille de l'AD (l'AD est située dans un plan conjugué avec la pupille de sortie (plan focal arrière) de l'objectif, Figure 1) :
où DAD est le diamètre du diaphragme d'ouverture, fl'objectif est la distance focale de l'objectif et Dep est le diamètre de la pupille de sortie de l'objectif. En règle générale, l'AD est laissé complètement ouvert pour l'imagerie de fluorescence, de sorte que l'INA est égal à l'AN de l'objectif. Dans un microscope à fluorescence, l'échelle AD n'indique pas son diamètre, donc l'INA ne peut pas être calculé. Il est possible de calibrer la taille de l'AD à l'aide d'un objectif. Pourtant, ce n'est pas nécessaire puisque la taille AD serait fixée à la taille qui produit le contraste le plus élevé.
- Préparez un échantillon de microtubules stabilisés marqués par fluorescence collés à la surface (étapes 4.1-4.2).
note: Nous avons utilisé des microtubules marqués à la tétraméthylrhodamine (Ex : 550 nm, Em : 580 nm).
- Faites la mise au point des microtubules à l’aide du bouton de mise au point du microscope tout en les imageant par fluorescence (si les microtubules ne sont pas marqués, imagez-les avec IRM ou DIC).
- Réglez l’exposition de l’appareil photo à 10 ms à l’aide du logiciel de l’appareil photo.
note: Cette exposition est arbitraire et une exposition de 100 ms fonctionnerait également.
- Fermez l’AD jusqu’à sa plus petite ouverture. Ajustez l'éclairage de manière à ce qu'il sature presque la plage dynamique de l'appareil photo ou au maximum possible.
note: À titre indicatif, utilisez la table de correspondance généralement fournie par le logiciel d’acquisition.
- Acquérez 10 images (en streaming ou en prenant une image toutes les secondes) d’un champ de vision contenant 10+ microtubules.
- Acquérez une image d’arrière-plan comme à l’étape 4.4.
- Modifiez la taille de l’AD et répétez les étapes 7.5-7.6 pour toute la plage d’ouverture de l’AD (de la taille de la pupille fermée à la taille de la pupille de sortie, Figure 2). Chaque fois que la taille de l’AD est modifiée, ajustez l’intensité de l’éclairage pour qu’elle corresponde à celle de l’étape 7.4.
- Pour chaque champ de vision acquis, soustrayez l’arrière-plan correspondant à l’aide du calculateur d’images > et en choisissant « soustraire » dans le menu déroulant. Assurez-vous que l’option « 32bit (float) result » est cochée. Faites ensuite la moyenne des images résultantes à l’aide de la pile de > d’images > du projet Z> moyenne.
- Mesurez le rapport signal/bruit de fond (SBR) des microtubules, défini comme l’intensité moyenne du signal des microtubules (intensité du microtubule moins l’intensité du bruit de fond) divisée par l’écart-type du bruit de fond (Figure 3).
- Déterminez la taille optimale de la DA (c’est-à-dire l’INA optimale) en calculant le SBR moyen des microtubules pour chaque taille d’ouverture, et réglez la taille de la DA à celle produisant le SBR le plus élevé (Figure 2). Il est possible qu’il existe une gamme de tailles AD qui produisent un contraste comparable.
