Microscopie statique à force atomique pour visualiser et caractériser les nucléosomes assemblés

Abstract

Source : Stormberg, T., et al. Sonder la structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de l’imagerie par microscopie à force atomique. J. Vis. Exp.(2019)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration de la microscopie statique à force atomique pour visualiser des nucléosomes assemblés. Cette technique d’imagerie à haute résolution permet d’étudier la structure des nucléosomes.

Protocol

1. Fonctionnalisation de la surface du mica pour l’imagerie AFM statique des nucléosomes

1. Préparer une solution mère de 50 mM de 1-(3-aminopropyle) silatrane APS dans de l’eau désionisée comme décrit. Conserver 1 mL d’aliquotes de cette solution à 4 °C jusqu’à utilisation.
   note: Les aliquotes peuvent être stockées pendant plus d’un an à 4 °C.
2. Préparez une solution APS 1:300 fonctionnelle pour la modification du mica en dissolvant 50 μL du stock APS de 50 mM dans 15 mL dd_{H 2}O.
   note: Cette solution de travail peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs jours.
3. Découpez des bandes de mica de 1 x 3 cm dans des feuilles de mica de haute qualité (voir le tableau des matériaux pour le mica utilisé ici).
   1. Vérifiez que la pièce s’adapte lorsqu’elle est placée en diagonale dans une cuvette. À l’aide de la pointe d’une pince à épiler bien aiguë, d’une lame de rasoir ou de ruban adhésif, vous pouvez cliver les couches de mica jusqu’à ce que les deux côtés soient fraîchement clivés et que la pièce soit aussi fine que ~0,1 mm (Figure 1A). Placez immédiatement le morceau de mica dans la cuvette remplie d’APS et incubez pendant 30 min (Figure 1B).
4. Transférez le morceau de mica dans une cuvette remplie de dd H2O et faites-le tremper pendant 30 s (figure 1C). Sécher complètement les deux faces de la bande de mica APS sous un flux d’argon.
   note: Une lingette non tissée en cellulose et polyester pour salle blanche (lingette recommandée détaillée dans les matériaux) peut être utilisée pour aider à évacuer l’eau du bord du mica lors du séchage.
5. Utilisez maintenant la bande de mica sec pour la préparation de l’échantillon. Sinon, conservez la pièce dans une cuvette propre et sèche (Figure 1D).
   note: Un stockage supplémentaire sous vide pendant 1 à 2 h est recommandé lorsque l’environnement est humide. Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Préparation d’échantillons de nucléosomes sur APS-Mica pour l’imagerie AFM statique

1. Appliquez du ruban adhésif double face sur plusieurs rondelles magnétiques et placez-les sur le côté.
2. Coupez le substrat APS-mica à la taille souhaitée (1 x 1 cm carrés pour l’instrument MM AFM utilisé ici). Placez ces morceaux dans une boîte de Pétri propre et gardez-les couverts.
3. Préparez trois dilutions des nucléosomes assemblés (concentrations finales de nucléosomes de 0,5, 1,0 et 2,0 nM) à l’aide d’un tampon filtré de 0,22 μm contenant 10 mM de HEPES pH 7,5 et 4 mM de MgCl₂,
   note: Pour limiter la perte de nucléosomes à la faible concentration finale, les dilutions doivent être faites une à la fois, immédiatement avant le dépôt sur l’APS-mica.
4. Déposez 5 à 10 μL de l’échantillon de nucléosome dilué au centre du morceau de mica APS et laissez-le incuber pendant deux minutes. Rincez doucement l’échantillon avec 2-3 mL de dd H₂O pour éliminer tous les composants du tampon. Après chaque utilisation de ~0,5 mL de dd H₂O, secouez doucement le mica pour éliminer l’excès d’eau de rinçage.
   note: Une seringue jetable est recommandée pour cette étape de rinçage.
5. Sécher l’échantillon déposé sous un léger jet de gaz argon propre.
   note: L’échantillon est maintenant prêt à être imagé ou peut être stocké dans une armoire à vide ou un dessiccateur rempli d’argon. Les échantillons préparés et entreposés conformément à la description ont été imagés un an après la préparation, sans perte de qualité. Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Imagerie AFM statique des nucléosomes

1. Montez un embout AFM sur le porte-embout. Utilisez une pointe qui a une constante de ressort de ~40 N/m et une fréquence de résonance comprise entre 300 et 340 kHz (voir le tableau des matériaux pour les porte-à-faux utilisés ici).
2. Monter l’échantillon préparé à la section 3 sur l’étage AFM en prenant soin de ne pas entrer en contact avec la surface de l’échantillon.
3. Positionnez le laser sur le porte-à-faux jusqu’à ce que la somme soit au maximum et ajustez les valeurs de déviation verticale et latérale à près de zéro.
4. Réglez la sonde AFM pour trouver sa fréquence de résonance, ajustez l’amplitude du variateur et réglez la taille de l’image sur 100 x 100 nm. Cliquez sur le bouton d’engagement pour commencer l’approche.
5. Une fois approché, optimisez progressivement le point de consigne d’amplitude jusqu’à ce que la surface de l’échantillon soit clairement visible. Augmentez la taille de numérisation à 1 x 1 μm et la résolution à 512 x 512 pixels. Cliquez sur le bouton de capture puis sur le bouton d’engagement pour commencer l’acquisition de l’image.
   note: Les images de la figure 2 montrent l’arrière-plan lisse auquel on peut s’attendre lors de l’imagerie de ces échantillons.

Results

Figure 1 : Schéma du processus de préparation du mica fonctionnalisé APS pour l’imagerie AFM des nucléosomes. (A) un morceau de mica de ~0,1 mm d’épaisseur a les deux côtés fraîchement clivés. (B) La pièce de mica clivée est rapidement placée en diagonale dans une cuvette contenant la solution APS et est réglée pour incuber pendant 30 min. (C) Après l’étape de fonctionnalisation de l’APS, la pièce de mica APS...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CENP-A/H4)2, humain recombinant	EpiCypher, Durham, Caroline du Nord	Référence 16-0010	Numéro de catalogue pour 50 ug
H2A/H2B, recombinant humain	EpiCypher, Durham, Caroline du Nord	Référence 15-0311	Numéro de catalogue pour 50 ug
H3 Octamère humain recombinant	EpiCypher, Durham, Caroline du Nord	Référence 16-0001	Numéro de catalogue pour 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Kit d’appareil de dialyse, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Référence 69574	Numéro de catalogue pour 10 appareils
chlorure de sodium	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	S9888-500G	Numéro de catalogue pour 500 mg
Filtres centrifuges Amicon Ultra-0,5 mL	Millipore-sigma, Burlington, Missouri	UFC501008	Numéro de catalogue pour 8 appareils
Hcl	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	Référence 258148-25ML	Numéro de catalogue pour 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	Réf. T0377-25G	Numéro de catalogue pour 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	11667289001	Numéro de catalogue pour 1 kg
Persulfate d’ammonium (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, Californie	Référence 1610700	Numéro de catalogue pour 10 g
Solution d’acrylamide/Bis à 30 %, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, Californie	1610158	Numéro de catalogue pour 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, Californie	Référence 1610800	Numéro de catalogue pour 5 mL
4x tampon d’échantillon de protéines Laemmli pour SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, Californie	1610747	Numéro de catalogue pour 10 mL
2-MOI	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	M6250-10ML	Numéro de catalogue pour 10 mL
ageRuler Échelle de protéines précolorées	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Référence 26616	Numéro de catalogue pour 500 uL
Teinture Coomassie Bio-Safe™	Bio-Rad, Hercules, Californie	1610786	Numéro de catalogue pour 1 L
Lingettes non tissées pour salles blanches : TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Caroline du Nord	TX604
Bloc de muscovite Mica	AshevilleMica, Newport News, Virginie	Grade 1
HEPES	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	H4034-25G	Numéro de catalogue pour 25 g
scotch	Scotch-3M, St. Paul, Minnesota
Sonde AFM TESPA-V2 (pour l’imagerie statique)	Sondes AFM Bruker, Camarillo, Californie
Filtre Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	SLGP05010	Numéro de catalogue pour 10 appareils
Sonde AFM BL-AC10DS-A2 (pour HS-AFM)	Olympus, Japon
Microscope à force atomique multimode	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Californie