Microscopie à force atomique à intervalle rapide pour capturer la dynamique des nucléosomes

Résumé

Source : Stumme-Diers, M. P., et al., Sonder la structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de l’imagerie par microscopie à force atomique.J. Vis. Exp.(2019)

Dans cette vidéo, nous démontrons des techniques d’imagerie de microscopie à force atomique à haute vitesse, AFM, pour étudier la dynamique des complexes de nucléosomes. Lorsque l’extrémité de l’AFM balaie la surface du nucléosome, elle détecte les altérations de la hauteur du nucléosome et enregistre le déballage de l’ADN au fil du temps.

Protocole

1. Assemblage par dilution continue de mononucléosomes

1. Générer et purifier un substrat d’ADN d’environ 400 pb qui contient une séquence de positionnement décentrée du nucléosome Widom 601.
   note: Pour limiter la formation indésirable de di-nucléosomes, chaque « bras » flanquant la séquence de positionnement ne doit pas dépasser ~150 pb.
   1. Utilisez le plasmide pGEM3Z-601 avec les amorces conçues et amplifiez l’ADN du substrat à l’aide de la PCR. Pour le substrat de 423 pb avec des longueurs de bras de 122 et 154 pb utilisé ici, utilisez des amorces avant (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') et inverses (5'-ACAGCTATGACCATGATGATTAC-3').
   2. Ajouter les tubes contenant le mélange réactionnel dans un thermocycleur préchauffé à 95 °C. Exécuter le programme suivant pendant 33 cycles après une dénaturation initiale pendant 5 min à 95 °C : dénaturation en 30 s à 95 °C, recuit en 30 s à 49 °C et extension en 35 s à 72 °C. Régler une extension finale à 72 °C pendant 10 min après les 33 cycles.
   3. Purifiez l’ADN du mélange PCR à l’aide d’un kit de purification PCR disponible dans le commerce. Lors de l’élution de l’ADN de la colonne de nettoyage par PCR, utilisez un tampon Tris de 10 mM (pH 7,5) à la place du tampon d’élution fourni par le kit.
      note: Faites très attention à ne pas transférer de tampons entre les étapes de purification. Un éluant contaminé peut causer des problèmes en aval lors de la mesure de la concentration d’ADN et/ou peut modifier la concentration initiale en sel du mélange d’assemblage de nucléosomes.
2. Déterminez la concentration d’ADN en mesurant l’absorbance de l’ADN purifié à 260 nm.
   1. Prélevez un blanc sur le spectrophotomètre UV VIS en utilisant uniquement le tampon d’élution Tris pH 7,5 de 10 mM. Recueillir une mesure de l’ADN purifié.
3. Une fois la concentration déterminée, aliquote 25 pmol de l’ADN purifié dans un tube à microfuge de 0,6 mL et placez-le dans une centrifugeuse à vide jusqu’à ce que la solution soit à peine visible ; cela prend généralement 30 min à 1 h.
   note: Le substrat d’ADN est maintenant prêt pour l’assemblage des nucléosomes. Sinon, le protocole peut être mis en pause ici et l’ADN stocké à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
4. Placez le tube de microfuge contenant les 25 pmol d’ADN sur la glace et ajoutez les composants de l’assemblage des nucléosomes du tableau 1, dans l’ordre indiqué. Lorsque tous les composants ont été ajoutés, retirez le mélange de la glace et incubez à température ambiante (RT) pendant 30 min.
   note: Il est essentiel de tenir compte de la teneur en sel de la zone tampon d’histones de la mère lors du calcul du NaCl nécessaire pour atteindre la concentration finale de 2 M.
5. Assembler les nucléosomes en réduisant la concentration en sel de 2 M du mélange à 200 mM en utilisant une dilution à vitesse continue.
   1. Remplissez une seringue avec 100 μL de tampon de dilution contenant 10 mM de Tris pH 7,5 et placez-la sur un pousse-seringue.
   2. Dirigez l'aiguille de la seringue à travers un trou pré-perforé dans le capuchon du tube du microfuge, en veillant à ce que le contact soit établi avec le mélange d'assemblage (Figure 1).
   3. Faites fonctionner le pousse-seringue à un débit de 0,75 μL/min pendant 120 min
      note: La solution résultante de 100 μL contient 250 nM de nucléosomes et 200 mM de NaCl.
   4. Transvaser le mélange dans un bouton de dialyse MWCO de 10 K et dialyser contre 200 mL d’un tampon pré-refroidi (4 °C) à faible teneur en sel contenant 10 mM de Tris pH 7,5, 0,25 mM d’EDTA et 2,5 mM de NaCl, pendant 1 heure à 4 °C.
6. Pour évaluer la teneur en histones de l’assemblage des nucléosomes, préparer un gel discontinu SDS-PAGE avec une séparation de 15 % et un empilement de 6 %, comme décrit précédemment.
   1. Aliquote 10 à 20 μL de la matrice de nucléosomes dans un tube de microfuge et ajoutez 4x Laemmli Sample Buffer à une concentration de travail de 1 à 2x.
   2. Comme contrôle, répétez cette préparation dans un tube microfuge séparé pour 1 à 2 μg de stock d’histones. Chauffer les échantillons à 95 °C pendant ~ 5 min.
   3. Chargez les échantillons dans des voies adjacentes les unes aux autres sur le gel. Ajoutez un échantillon de tampon aux voies inutilisées pour favoriser une migration uniforme des bandes.
   4. Faites fonctionner le gel à 65 V jusqu’à ce que la face du colorant se déplace à travers le gel d’empilage. Lorsque le gel de séparation est atteint, augmentez-le à 150 V et faites fonctionner jusqu’à ce que le front de colorant ait complètement migré hors du gel.
   5. Démontez l’unité d’électrophorèse et transférez doucement le gel dans un récipient de coloration rempli de dd H₂O. Laissez le gel reposer pendant 5 minutes en agitant doucement. Répétez ce processus deux fois de plus avec du jd frais H₂O utilisé à chaque fois.
      note: La teinture Coomassie utilisée dans ce protocole ne nécessite pas les étapes de fixation typiques nécessaires aux teintures Coomassie (voir le tableau des matériaux). Si une autre préparation Coomassie est utilisée, ajustez les étapes de fixation au besoin.
   6. Retirez l’eau du rinçage final et ajoutez juste assez de teinture pour couvrir le gel. Laissez le gel reposer en agitant doucement pendant au moins 1 h
      note: Pour l’agitation, le récipient de coloration peut être placé sur n’importe quel appareil qui favorise le mouvement de la tache sur le gel tout en gardant le gel recouvert de liquide.
   7. Retirez la tache du récipient et rincez le gel avec du dd H₂O. Remplacez le dd H₂O et faites tremper le gel pendant 30 min en l’agitant doucement. (Le gel doit ressembler à celui montré sur la figure 2, avec une séparation claire des bandes d’histones.)
7. Stocker les nucléosomes à 4 °C jusqu’à utilisation.
   note: Lorsqu’ils sont stockés dans ces conditions, les nucléosomes restent stables pendant plusieurs mois. Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Imagerie AFM Time-lapse à grande vitesse de la dynamique des nucléosomes

NOTE : Le protocole ci-dessous est fourni pour l’instrument HS-AFM développé par le groupe Ando (Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon).

1. Préparez l’APS-mica pour l’imagerie liquide.
   1. Fixez la tige de verre à la platine du scanner AFM à l’aide de la colle du scanner de tige de verre (voir tableau des matériaux). Laissez sécher pendant au moins 10 minutes.
   2. Faites des morceaux circulaires de mica de ~0,1 mm d’épaisseur avec un diamètre de 1,5 mm en les perforant à partir d’une feuille de mica plus grande. Utilisez la colle à tige de mica-verre HS-AFM (voir le tableau des matériaux) pour fixer cette pièce de mica à la tige de verre sur le HS-AFM et séchez, intacte, pendant au moins 10 minutes. Couvrez les couches à l’aide d’un ruban sensible à la pression jusqu’à ce qu’une couche bien clivée apparaisse sur le ruban.
   3. Diluer 1 μL de stock APS 50 mM dans 99 μL de dd H₂O pour obtenir une solution APS 500 μM. Déposer 2,5 μL de cette solution sur la surface du mica fraîchement clivé et laisser fonctionnaliser pendant 30 min.
      note: Pour éviter le dessèchement de la surface lors de la fonctionnalisation, le capuchon d’un tube à centrifuger conique de 50 ml peut être ajusté avec un morceau de papier filtre humide et placé sur le scanner. La crosse APS est diluée 3 fois moins pour l’imagerie liquide que pour l’imagerie statique afin de contrôler la dynamique à une vitesse qui peut être observée avec AFM.
   4. Rincer le mica avec 20 μL de dd H₂O en appliquant plusieurs rinçages de ~3 μL. Retirez complètement l’eau après chaque rinçage en plaçant une lingette non tissée sur le bord du mica. Après le rinçage final, placez ~3 μL de dd H₂O sur la surface et laissez reposer pendant au moins 5 minutes pour éliminer tout APS non spécifiquement lié.
2. Placez la sonde dans le support HS-AFM et positionnez le support sur la platine AFM avec la pointe vers le haut. Rincer le support à l’aide de ~100 μL de dd H₂O suivi de deux rinçages de ~100 μL de tampon d’imagerie de nucléosomes filtrés de 0,22 μm contenant 10 mM de HEPES pH 7,5 et 4 mM de MgCl₂.
3. Une fois les rinçages terminés, remplissez la chambre avec ~100 μL de tampon d’imagerie des nucléosomes, en immergeant l’extrémité. Ajustez la position du porte-à-faux jusqu’à ce qu’il soit touché par le laser. Rincez le mica APS avec 20 μL de tampon d’imagerie de nucléosomes filtré, en utilisant ~4 μL par rinçage.
4. Diluer 1 μL du stock d’assemblage de nucléosomes dans 250 μL de tampon d’imagerie de nucléosomes filtré pour une concentration finale de nucléosomes de 1 nM. Déposez 2,5 μL de cette dilution sur la surface et laissez reposer pendant 2 min. Rincer la surface avec ~ 4 μL de tampon d’imagerie de nucléosomes deux fois. Après le rinçage final, laissez la surface recouverte dans le tampon d’imagerie.
   note: Si la surface n’est pas rincée après le dépôt de l’échantillon de nucléosomes, la surface deviendra rapidement surpeuplée.
5. Placez le scanner et l’échantillon sur le dessus du porte-pointe de manière à ce que l’échantillon soit face vers le bas. Pour commencer l’approche, utilisez la fonction d’approche automatique avec une amplitude de point de consigne, A_s proche de l’amplitude d’oscillation libre A₀.
   note: Idéalement, A_s = 0,95 A₀, cependant, fonctionner à 82 % de A₀ fonctionnera aussi bien si vous faites attention.
6. Ajustez le point de consigne jusqu’à ce que la surface soit bien suivie.
   note: Pour minimiser le transfert d’énergie de l’extrémité de l’AFM à l’échantillon de nucléosome, l’amplitude du cantilever doit être maintenue faible, avec des amplitudes aussi faibles que 1 nm optimales.
7. Réglez la zone d’image entre 150 x 150 nm et 200 x 200 nm avec un taux d’acquisition de données de ~300 ms par image d’imagerie.
   note: Cette taille d’image est généralement suffisante pour capturer la dynamique de plusieurs nucléosomes simultanément. Une surface moins peuplée peut nécessiter des modifications de ces paramètres. La fréquence d’images suggérée est suffisante pour capturer la dynamique des nucléosomes telle que le bouclage, le glissement et le dépliage, entre autres (voir la section Résultats représentatifs ci-dessous).

Tableau 1 : Réactifs nécessaires à l’assemblage continu de nucléosomes à gradient de sel. Chacun des composants énumérés est ajouté au tube de microfuge contenant l’ADN purifié. Cela doit être fait dans l’ordre dans lequel les réactifs sont énumérés dans le tableau, avec l’eau et le NaCl ajoutés en premier, suivis du dimère H2A/H2B et du tétramère d’histones ajoutés en dernier. Si des octamères d’histones pré-pliés doivent être utilisés, ajoutez-les dans le même rapport que pour le tétramère ci-dessus. *Prenez note de la teneur en NaCl dans chacune des souches d’histones et ajustez le NaCl 5M pour ajouter en conséquence, le [NaCl] final doit être égal à 2M. (Voir le tableau des matériaux).

Résultats

Figure 1 : Schéma de la pompe à seringue utilisée pour l’assemblage de nucléosomes à l’échelle microscopique.Le mélange d’assemblage est positionné de manière à être en contact avec l’extrémité de l’aiguille de la seringue. Lorsque le tampon de dilution est délivré par la pompe à seringue dans le mélange d’assemblage, la concentration de NaCl est diminuée, ce qui favorise l’assemblage des nucléosomes. Cette figure est adaptée...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plasmide pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	Référence 26656
Amorces PCR	IDT, Coralville, IA	Commande personnalisée	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
Polymérase DreamTaq	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Numéro de catalogue pour 200 unités
Kit de purification PCR	Qiagen, Hilden, Allemagne	Référence 28104	Numéro de catalogue pour 50 unités
Base Tris	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	10708976001	Numéro de catalogue pour 250 g
Edta	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Numéro de catalogue pour 500 g
(CENP-A/H4)2, humain recombinant	EpiCypher, Durham, Caroline du Nord	Référence 16-0010	Numéro de catalogue pour 50 ug
H2A/H2B, recombinant humain	EpiCypher, Durham, Caroline du Nord	Référence 15-0311	Numéro de catalogue pour 50 ug
H3 Octamère humain recombinant	EpiCypher, Durham, Caroline du Nord	Référence 16-0001	Numéro de catalogue pour 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Kit d’appareil de dialyse, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Référence 69574	Numéro de catalogue pour 10 appareils
chlorure de sodium	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	S9888-500G	Numéro de catalogue pour 500 mg
Filtres centrifuges Amicon Ultra-0,5 mL	Millipore-sigma, Burlington, Missouri	UFC501008	Numéro de catalogue pour 8 appareils
Hcl	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	Référence 258148-25ML	Numéro de catalogue pour 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	Réf. T0377-25G	Numéro de catalogue pour 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	11667289001	Numéro de catalogue pour 1 kg
Persulfate d’ammonium (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, Californie	Référence 1610700	Numéro de catalogue pour 10 g
Solution d’acrylamide/Bis à 30 %, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, Californie	1610158	Numéro de catalogue pour 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, Californie	Référence 1610800	Numéro de catalogue pour 5 mL
4x tampon d’échantillon de protéines Laemmli pour SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, Californie	1610747	Numéro de catalogue pour 10 mL
2-MOI	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	M6250-10ML	Numéro de catalogue pour 10 mL
PageRuler Échelle de protéines précolorées	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Référence 26616	Numéro de catalogue pour 500 uL
Teinture Coomassie Bio-Safe™	Bio-Rad, Hercules, Californie	1610786	Numéro de catalogue pour 1 L
Lingettes non tissées pour salles blanches : TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Caroline du Nord	TX604
Bloc de muscovite Mica	AshevilleMica, Newport News, Virginie	Grade 1
Aminopropyl silatrane (APS)	Synthétisé comme décrit au point 22
HEPES	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	H4034-25G	Numéro de catalogue pour 25 g
scotch	Scotch-3M, St. Paul, Minnesota
Colle Krazy Industrielle Aron Alpha	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	Numéro de catalogue pour tube de 2 g
MgCl2	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	Référence M8266-100G	Numéro de catalogue pour 100 g
Filtre Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	SLGP05010	Numéro de catalogue pour 10 appareils
Sonde AFM BL-AC10DS-A2 (pour HS-AFM)	Olympus, Japon
Composé FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japon
Composé FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japon
Microsocopie à force atomique à intervalle temporel à grande vitesse	Toshio Ando, Institut des sciences de la nano-vie, Université de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japon