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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local
1. Fixation primaire, post-fixation, enrobage, sectionnement et contraste
- Préparez 1,6 mL de solution fixatrice primaire (glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon de cacodylate de sodium à 0,1 M (pH 7,3)) dans un tube de microcentrifugation de 2 mL. Conservez-le à 5 °C pendant 14 jours maximum.
- À partir de la biopsie musculaire ou du muscle entier, isolez un petit échantillon, qui a un diamètre maximal de 1 mm dans n’importe quelle direction et qui est un peu plus long dans le sens longitudinal de la fibre que dans le sens de la section transversale (à des fins d’orientation).
- Placez l’échantillon dans le tube contenant la solution de fixation primaire froide. Conservez-le à 5 °C pendant 24 h.
- Laver l’échantillon quatre fois (15 min entre chaque lavage) avec un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,3). À l’aide de pipettes de transfert, retirez le tampon usagé du tube en laissant l’échantillon intact, puis ajoutez le tampon frais.
note: Après le lavage final, l’échantillon peut être stocké dans le tampon cacodylate de sodium 0,1 M à 5 °C pendant plusieurs mois. Le protocole peut être mis en pause ici.
- Postfix avec 1 % de tétroxyde d’osmium (OsO4) et 1,5 % de ferrocyanure de potassium (K4Fe(CN)6) dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,3) pendant 120 min à 4 °C
note: L’utilisation de ferrocyanure de potassium à 1,5 % (K4Fe(CN)6) est essentielle pour un contraste optimal des particules de glycogène.
- Rincer deux fois à l’eau bi-distillée à température ambiante (RT).
- Déshydrater en l’immergeant dans une série graduée d’alcool (éthanol) à la RT en utilisant les concentrations suivantes : 70 % (10 min), 70 % (10 min), 95 % (10 min), 100 % (10 min) et 100 % (10 min).
note: À chaque étape, l’échantillon est immergé dans de l’éthanol, qui n’est ensuite que partiellement retiré pour éviter de dessécher l’échantillon. Enfin, l’éthanol restant est jeté.
- Infiltrer avec des mélanges gradués d’oxyde de propylène et de résine éposidique à RT en utilisant les rapports de volume suivants (oxyde de propylène/résine éposside) : 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (pendant la nuit). Le lendemain, enrober les échantillons dans de la résine éposidique 100 % fraîche dans des moules et polymériser à 60 °C pendant 48 h.
- Coupez des sections ultra-minces (60-70 nm) de fibres orientées longitudinalement et collectez-les sur des grilles de cuivre à un trou comme suit.
- Montez le bloc d’un échantillon sur le support d’ultramicrotome.
- Coupez le bloc en surface avec une lame de rasoir afin d’atteindre le niveau du tissu.
- Montez un couteau diamanté (ultra cut 45) devant l’échantillon et alignez la surface de l’échantillon parallèlement au couteau.
- Réaliser une coupe semi-fine (1 μm) à l’aide du couteau diamanté pour vérifier l’orientation de l’échantillon. Colorer la section semi-mince avec du bleu de toluidine pour l’observation en microscopie optique.
- Coupez davantage le bloc pour réduire la zone d’intérêt afin d’obtenir des sections ultraminces appropriées.
- Coupez des sections ultra-fines (60-70 nm) avec un deuxième couteau diamanté (ultra cut 45).
- Collectez 1 à 2 sections sur des grilles en cuivre à un trou à l’aide d’un Perfect Loop.
note: La grille en cuivre à un trou a un seul trou au milieu avec une membrane de support Formvar.
- Contrastez les sections avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb en immergeant les grilles ci-dessus dans une solution d’acétate d’uranyle (0,5 % dans de l’eau doublement distillée) pendant 20 min, puis dans une solution de citrate de plomb (1 % dans de l’eau doublement distillée) pendant 15 min. Lavez les grilles dans de l’eau doublement distillée entre et après les deux taches.
note: Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Imagerie
- Allumez le microscope électronique à transmission (fonctionnant à une tension d’accélération de 80 kV), l’ordinateur et le logiciel d’enregistrement d’images. Enregistrez des images numériques à l’aide d’une caméra CCD numérique à balayage lent 2 k x 2 k et du logiciel d’imagerie associé.
- Insérez la grille à plusieurs sections dans la platine du microscope.
- Passez d’abord la grille à faible grossissement (par exemple, x100) pour déterminer la qualité des sections (c’est-à-dire les trous dans la membrane de support, les débris, etc.) et choisissez les sections de la meilleure qualité. À faible grossissement, déterminez la direction des fibres musculaires.
- Ensuite, augmentez le grossissement avec le faisceau centré sur une fibre périphérique dans la section. Faites la mise au point de l’image à un grossissement supérieur à 30 k pour garantir suffisamment de détails fins dans l’image, guidés par une transformation de Fourier rapide en temps réel, si disponible. Enfin, enregistrez des images avec un temps d’exposition de 1 s au grossissement souhaité.
- Acquérir un total de 24 images d’une fibre sélectionnée au hasard, c’est-à-dire 12 images de l’espace myofibrillaire et 12 images de l’espace sous-sarcolemmal, à un grossissement compris entre 10 k et 40 k. S’assurer que les images sont réparties sur la longueur et la largeur de la fibre dans un ordre aléatoire mais systématique pour obtenir des résultats non biaisés (Figure 1A).
note: Le grossissement optimal dépend de la résolution de l’appareil photo disponible et de la taille des micrographies. L’objectif est d’obtenir une résolution finale, où les diamètres des particules de glycogène peuvent être mesurés par pas de 1 nm, et d’inclure une aire totale de la région myofibrillaire d’au moins 70 μm2 et une longueur totale de la fibre d’au moins 25 μm réparties en 12 images de l’espace myofibrillaire et 12 images de l’espace sous-sarcolemmal par fibre, respectivement. Les 24 images par fibre donneront très probablement une précision (coefficient d’erreur) du contenu volumétrique des différents pools de glycogène entre 0,1 et 0,2 dans les fibres individuelles des muscles squelettiques de l’homme, du rat et de la souris (Figure 2E).
- Répétez les étapes 2.4 et 2.5 jusqu’à ce qu’un total de 6 à 10 fibres soient imagées. Si nécessaire, coupez des sections supplémentaires (séparées d’au moins 150 μm pour éviter le chevauchement des fibres déjà imagées) et répétez les étapes 1.9-2.5.
3. Analyses d’images
- Importez des images dans ImageJ en cliquant sur Fichier > Ouvrir.
- Réglez l’échelle globale pour qu’elle corresponde à la taille d’origine de l’image en cliquant sur Analyser > Définir l’échelle.
- Zoomez à 100 % en cliquant sur l’image > Zoom > avant.
- Mesurez l’épaisseur d’un disque Z par image de l’espace myofibrillaire (12 par fibre) à l’aide de l’outil Ligne droite du menu Outils (Figure 1D). Calculez l’épaisseur moyenne du disque Z de chacune des 6 à 10 fibres.
- Définissez 2-3 fibres avec le disque Z moyen le plus épais comme des fibres de type 1 et 2-3 fibres avec le disque Z moyen le plus fin comme des fibres de type 2. Ne tenez pas compte des fibres intermédiaires 2-4 pour des analyses plus approfondies (Figure 1E).
REMARQUE : Les étapes suivantes sont répétées pour chacune des 4 à 6 fibres de l’échantillon. Les fractions volumiques du glycogène sont estimées par comptage de points. La taille des grilles est choisie pour obtenir une grande précision satisfaisante des estimations. Ceci est souvent obtenu en réalisant 250 coups, ce qui dicte ensuite le nombre total de points nécessaires et, à son tour, la zone par point.
- Utilisez l’outil Ligne segmentée pour mesurer la longueur de la myofibrille la plus externe visible juste en dessous de la région sous-sarcolemmale (Figure 2A).
note: Cette longueur est utilisée pour exprimer le glycogène sous-sarcolemmal par surface (c’est-à-dire la longueur de la myofibrille la plus externe multipliée par l’épaisseur de la section (60 nm) ; voir étape 4.5). Par conséquent, seule la région sous-sarcolemmale, qui est représentée par cette longueur, est incluse dans l’analyse.
- Insérez une grille en cliquant sur Analyser les outils > > Grille et définissez la surface par point à 32 400 nm2. Comptez le nombre d’occurrences dans la longueur disponible dans les 12 images sous-sarcolemmales, où une croix frappe le glycogène sous-sarcolemmal (Figure 2A). Un hit est défini comme une particule de glycogène présente dans le coin supérieur droit d’une croix.
- Insérez une grille en cliquant sur Outils d’analyse > > Grille et définissez la surface par point à 160 000 nm2. Comptez le nombre de coups dans les 12 images myofibrillaires, où une croix frappe l’espace intramyofibrillaire (Figure 2B).
- Insérez une grille en cliquant sur Analyser les outils > > Grille et définissez la surface par point à 3 600 nm2. Comptez le nombre de coups dans les 12 images myofibrillaires, où un croisement frappe le glycogène intramyofibrillaire (Figure 2C).
- Insérez une grille en cliquant sur Analyser les outils > > Grille et définissez la surface par point à 32 400 nm2. Comptez le nombre de coups dans les 12 images myofibrillaires, où une croix frappe le glycogène intermyofibrillaire (Figure 2D).
- À l’aide de l’outil Ligne droite, mesurez le diamètre de cinq particules de glycogène choisies au hasard de chaque bassin pour chacune des 12 images afin d’obtenir une moyenne de 60 particules par bassin et par fibre.
REMARQUE : La moyenne de 60 particules couvre en grande partie la variation au sein de la fibre (Figure 2F).
