1. Lignée cellulaire et culture cellulaire
- Cultivez des macrophages RAW 264.7 dans le milieu Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % (vol/vol) de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2. Remplacez le milieu de culture tous les deux jours.
- Lorsque les cellules deviennent confluentes à 80 %, lavez la plaque deux fois avec du PBS stérile.
- Détachez les cellules en ajoutant 1 000 μL de trypsine-EDTA à 0,5 % et incubez la plaque de culture cellulaire pendant 3 à 5 minutes dans un incubateur humidifié à 37 °C.
- Examinez la plaque au microscope optique pour confirmer la dissociation cellulaire. Ajouter 10 mL de milieu de croissance contenant 10 % de FBS pour inactiver la trypsine.
- Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettez doucement les cellules en suspension dans le milieu de culture cellulaire complet et déterminez le nombre de cellules et la viabilité à l’aide de la >note: La viabilité cellulaire minimale recommandée pour cette expérience est de >90 %.
- Placez des lamelles en verre stériles dans les puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’une pince autoclave. Ensemencer les cellules sur des lamelles à une densité de 1 x 106 cellules/mL et incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
- Changez le milieu de chaque puits avec un milieu complet frais de 500 μL avant le traitement. Prétraiter les macrophages avec un véhicule (DMSO ou autres solvants utilisés pour dissoudre l’EIPA) ou l’inhibiteur de macropinocytose 5-(N-éthyl-N-isopropyl)-amiloride (EIPA, 25 μM) pendant 30 min.
- Traiter les cellules avec un véhicule et des stimulateurs de macropinocytose pour favoriser l’ébouriffement de la membrane : phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA, 1 μM, 30 min) et facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min).
note: D’autres inhibiteurs de la macropinocytose [p. ex., latrunculine A (1 μM, 30 min) ou cytochalasine D (1 μM, 30 min)] et stimulateurs [p. ex., facteur de croissance épidermique (EGF, 100 ng/mL, 10 min) ou facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] de la macropinocytose peuvent également être utilisés pour caractériser la macropinocytose dans les macrophages et d’autres types de cellules. Les cellules peuvent nécessiter une famine sérique pendant la nuit avant le traitement par des stimulateurs physiologiques de la macropinocytose. Il est important de noter que les concentrations et les temps d’incubation les plus efficaces devront être déterminés pour stimuler la macropinocytose dans d’autres types de cellules.
2. Fixation MEB
- Après le traitement, aspirez le média des puits et lavez deux fois les lamelles avec du PBS glacé.
- Fixer les cellules (4 % de paraformaldéhyde et 2 % de glutaraldéhyde dans du cacodylate de sodium 0,1 M) pendant 30 min à température ambiante, suivie d’une nuit d’incubation dans le fixateur à 4 °C.
- Laver et incuber délicatement les lamelles avec 500 μL des réactifs suivants sans perturber la monocouche cellulaire.
- Laver une fois dans du cacodylate de sodium de 0,1 M et incuber pendant 15 min.
- Laver deux fois avec dH2O avec 10 min d’incubation à chaque lavage.
- Laver deux fois avec de l’éthanol à 25 % avec 10 min d’incubation à chaque lavage.
- Laver deux fois avec de l’éthanol à 50 % avec 10 min d’incubation à chaque lavage.
- Laver deux fois avec de l’éthanol à 75 % avec 10 min d’incubation à chaque lavage.
- Laver deux fois avec de l’éthanol à 80 % avec 10 min d’incubation à chaque lavage.
- Laver deux fois avec de l’éthanol à 95 % avec 10 min d’incubation à chaque lavage.
- Laver deux fois avec de l’éthanol à 100 %. Effectuer 10 min d’incubation dans chaque lavage.
note: Le changement/remplacement des réactifs doit être effectué rapidement pour éviter le dessèchement à l’air des cellules. Les lamelles peuvent être laissées dans de l’éthanol à 100 % pendant plusieurs jours à 4 °C. Pour un stockage à long terme, ajoutez de l’éthanol à 100 % et couvrez les puits avec du parafilm pour éviter le dessèchement à l’air de l’échantillon.
3. Séchage du point critique
- Placez les lamelles dans un séchoir à point critique et couvrez-les avec de l’éthanol à 100 %. Appuyez sur le bouton d’alimentation et ouvrez le réservoir de CO2.
- Appuyez sur le bouton Cool pendant environ 30 s jusqu’à ce que la température descende à 0 °C. Appuyez sur le bouton Fill jusqu’à ce qu’une bulle apparaisse dans la fenêtre de la chambre.
- Appuyez sur le bouton de purge jusqu’à ce que l’odeur d’éthanol provenant de l’échappement de purge disparaisse. Appuyez à nouveau sur le bouton Cool jusqu’à ce que la température descende à 0 °C.
- Appuyez à nouveau sur les boutons Fill et Purge pour les désactiver et fermer le réservoir de CO2. Appuyez à nouveau sur le bouton Cool pour l’éteindre et appuyez sur le bouton Heat.
- Réglez la température à 42 °C et la pression à 1 200 psi. Une fois que la pression et la température se stabilisent, appuyez sur le bouton Bleed pour permettre à la pression de diminuer lentement.
- Une fois que la pression de la chambre atteint 150 psi, appuyez sur le bouton Vent et attendez que la pression descende à 0 psi. Éteignez le séchoir à point critique et retirez les lamelles.
- Montez les lamelles sur des supports d’échantillons en aluminium MEB à l’aide de languettes d’adhésif carbone et soumises à un revêtement par pulvérisation cathodique à l’aide d’or/palladium dans une coucheuse par pulvérisation.
- Allumez le bouton d’alimentation et attendez que l’aspirateur atteigne 30 mTorr. Rincez la chambre pour éliminer l’humidité et l’air en éteignant l’interrupteur de gaz et en tournant la vanne de gaz Fine dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
- Une fois que le vide atteint 200 mTorr, éteignez l’interrupteur à gaz et attendez que le vide atteigne 30 mTorr. Répétez cette étape 3 fois.
- Appuyez sur le bouton de la minuterie et ajustez le bouton de tension jusqu’à ce que la jauge indique 10 mA. Retirez les lamelles revêtues de la chambre.
note: Suivez les instructions du fabricant pour effectuer le séchage des points critiques et l'enrobage par pulvérisation cathodique de l'échantillon.
4. Imagerie et quantification
- Insérez des lamelles d’échantillon dans la chambre d’un microscope électronique à balayage. Fermez la porte et appuyez sur le bouton Evac.
- Ouvrez le logiciel d’exploitation SEM. Réglez la tension d’accélération à 15 kv et la distance de travail à 10 mm.
- Appuyez sur le bouton Coordonnées et déplacez-vous dans le contrôleur jusqu’à ce que les cellules apparaissent au centre de l’écran d’observation. Réglez le grossissement sur 3 500x et imagez l’échantillon en cliquant sur le bouton Photo.
note: Utilisez un niveau de grossissement plus élevé (8 500x à 16 000x) pour montrer la membrane plasmique avec plus de détails.
