Microscopie à fluorescence intravitale pour étudier la formation de thrombus microvasculaires

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Prédisposition des animaux

1. Pesez une souris et chargez le médicament correspondant (par exemple, le cannabinoïde, 5 mg/kg de poids corporel (p.c.) dans une seringue à insuline. Administrer le médicament 30 minutes avant l’induction du thrombus.
2. En tenant le cou de la souris entre le pouce et l’index et la queue de la souris avec l’auriculaire, étirez l’animal et injectez le médicament par voie intrapéritonéale (ip) dans le quadrant inférieur gauche de l’abdomen. Remettez l’animal dans la cage pendant 15 min.
3. Préparez l’anesthésie avec de la kétamine (90 mg/kg p.c.) et de la xylazine (25 mg/kg p.c.). 15 min avant l’induction du thrombus, anesthésiez la souris. Mettez la souris dans la cage, tirez légèrement sur la queue et injectez les anesthésiques avec une seringue à insuline.
4. Remettez la souris dans la cage jusqu’au début de l’anesthésie. Pour vérifier une anesthésie suffisante, pincez la queue avec une pince.
5. Chargez 0,05 mL de dextran marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine décongelé (FITC-dextran ; 5 %, 150 kDa) dans une seringue à insuline. Pendant le remplissage de la seringue, assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles d’air, car même de petites bulles d’air administrées par voie intraveineuse (iv) peuvent être mortelles pour l’animal.
6. Placez la souris anesthésiée sur une plaque chauffante en position face cachée. Réglez la plaque chauffante à 37 °C.
7. Mettez une pommade oculaire sur la cornée de la souris. Désinfectez la peau et utilisez des instruments stériles.
8. Coudre deux sutures de polypropylène 7/0 dans le bord crânien et caudal de l’oreille droite. Placez les points aussi près du bord et aussi près que possible de la base (Figure 1B).
9. Déplacez la souris en position dorsale. Fixez tous les pieds à la plate-forme en verre acrylique à l’aide de bandes adhésives. Accrochez une suture sous les dents de devant et positionnez la tête en dorsiflexion en collant la suture sur le verre acrylique à l’aide de bandes adhésives.
10. Transplacez l’animal sur la plate-forme sous l’opération stéréomicroscope. Utilisez un grossissement de 16X.

2. Préparation de la veine jugulaire gauche et injection de FITC-Dextran

Remarque : Pour la microscopie de l’oreille droite, préparez la veine jugulaire gauche.

1. À l’aide d’un scalpel, faites une incision de 5 mm dans la peau du côté gauche du cou dans une direction cranio-caudale. Disséquez le tissu sous-cutané à l’aide de micropinces et de microciseaux. Soit ligaturer les vaisseaux croisés avec des sutures en polyester 8/0, soit avec électrocoagulation.
2. Libérez la veine de ses adventices à l’aide de micro-pinces et de microciseaux sans toucher le vaisseau.
3. Utilisez la seringue à insuline préparée pour l’injection du colorant fluorescent. Saisissez délicatement la paroi du vaisseau avec la micropince, sans perforer la veine. Pénétrer la paroi distendue du vaisseau avec la seringue et injecter FITC-dextran iv.
4. Arrêtez le saignement après avoir retiré la seringue à l’aide de cotons-tiges. Évitez la contamination de l’oreille par le sang et les colorants.

3. Positionnement de l’oreille droite pour la microscopie à fluorescence intravitale

1. Transférez l’animal sur la plaque chauffante dans une construction en verre acrylique avec une fente pour la plaque chauffante et un plan de 0,5 cm de haut pour positionner l’oreille.
2. Fixez l’animal face cachée sur la plaque chauffante à l’aide de bandes adhésives. Placez le cartilage relativement fort et convexe à la base de l’oreille à côté des plans de 0,5 cm de haut pour l’oreille (Figure 1B) afin que la partie apicale de l’oreille puisse être positionnée à plat sur le plan.
3. Ajoutez une goutte de NaCl 0,9 % à température ambiante dans le plan en verre acrylique afin de positionner l’oreille. Placez l’oreille droite, avec les sutures prédisposées sur sa face ventrale concave vers le bas, sur la goutte de NaCl à 0,9 %. À l’aide de cotons-tiges, absorbez la goutte de NaCl et laissez les forces capillaires fixer le plan de l’oreille au verre acrylique.
4. Collez les sutures sur le verre acrylique pour fixer la position de l’oreille.
5. Ajoutez une goutte de NaCl à 0,9 % à température ambiante sur la face dorsale convexe de l’oreille. Placez soigneusement une lamelle (0,5 cm de diamètre) sur l’oreille sans comprimer les vaisseaux basaux qui pénètrent dans l’oreille. À l’aide de cotons-tiges, retirez autant de NaCl que possible sous la lamelle afin de minimiser la distance entre la lamelle et les vaisseaux cibles de l’oreille.

4. Microscopie à fluorescence intravitale et induction de thrombus de l’oreille droite

1. Régler le microscope à fluorescence intravital pour la visualisation FITC-dextran (450 - 490 nm ; FT : 510 ; LP : 520). Utilisez une lampe au mercure variable de 100 W comme source de lumière. Connectez une caméra CCD haute résolution en noir et blanc à un graveur de DVD.
2. Transférez l’animal sur le verre acrylique contenant la plaque chauffante avec l’oreille abductée fixe sur le bureau du microscope à fluorescence intravital.
3. À l’aide d’un grossissement de 20X (ouverture numérique de 20X/0,95) et d’une intensité lumineuse de 20 %, recherchez un vaisseau veineux de 50 à 60 m de diamètre et avec un débit sanguin antérograde de 400 à 600 m/s.
4. Ajoutez une goutte d’eau à température ambiante dans la lamelle pour l’immersion dans l’eau de l’objectif à grossissement 63x (ouverture numérique 63X/0,95). À l’aide d’une seringue munie d’une canule de 1 mm de diamètre, placez la goutte sur l’objectif du microscope. Ajoutez juste assez d’eau pour entrer en contact avec la lamelle et l’objectif avec la goutte d’eau.
5. Immédiatement après l’application de la goutte d’eau, commencez à enregistrer le récipient pendant 20 s avec une intensité lumineuse de 20 % pour la mesure hors ligne du diamètre et du débit sanguin.
6. Commencer l’induction du thrombus 5 min après l’injection de FITC-dextran. Pour ce faire, augmentez l’intensité lumineuse à 100 %.
7. Lors de l’induction d’un thrombus, fermez l’ouverture du microscope pendant 2 s sur une période de 30 s pour vérifier le flux sanguin. En cas de circulation sanguine persistante, ouvrez à nouveau l’ouverture. En cas d’arrêt du flux sanguin, observer le vaisseau pendant 30 s.
   note: Le vaisseau est classé comme occlus si le flux reste immobile pendant 30 secondes ou plus ou si le sang circule rétrogradement. Si le flux sanguin orthograde recommence, ouvrez complètement l’ouverture et continuez l’induction du thrombus jusqu’à ce que l’occlusion du vaisseau se produise comme décrit ci-dessus. Lors de l’induction précoce d’un thrombus, assurez-vous que les temps pendant lesquels l’ouverture a été fermée pour vérifier le flux sanguin sont aussi courts que possible afin de maintenir une épi-illumination presque continue. Plus tard, pendant la croissance du thrombus, le vaisseau est perfusé avec un colorant moins fluorescent, de sorte qu’il peut être observé en continu.
8. Sélectionnez et obstruez 5 vaisseaux par oreille. Limiter le temps d’induction du thrombus au microscope à environ 1 h après l’injection de FITC-dextran.

Graphique 1. Préparation de la veine jugulaire (A) et mise en place de l’oreille pour la microscopie intravitale (B). (A) À l’aide de l’opération stéréomicroscope, la veine jugulaire droite est préparée. Les sutures pour la mise en place de l’oreille gauche sont cousues avant l’injection de FITC-dextran. La plaie de la dissection antérieure de la veine jugulaire gauche est fermée par des sutures transcutanées (B). L’oreille gauche est fixée par des sutures en polypropylène 7/0. Une lamelle est soigneusement placée sans comprimer les vaisseaux basaux de l’oreille. Une plaque chauffante maintient la température corporelle de l’animal pendant toute la durée de l’expérience.