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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Préparation des cytospins
- Préparer deux cytospins avec des cellules mononucléées des échantillons du patient (c.-à-d. un cytospin pour la coloration par immunofluorescence γH2AX et un cytospin pour la coloration par immunofluorescence combinée γH2AX et 53BP1) par centrifugation (300 x g, 10 min) de1,0 x 10 5 cellules pour chaque préparation (figures 1 et 2).
2. Coloration par immunofluorescence γH2AX et 53BP1
- Fixation et perméabilisation : Fixer les cellules avec 200 μL de PFA à 4 % pendant 10 min. Après la fixation, lavez doucement les cellules trois fois avec 30 ml de PBS pendant 5 minutes chacune sur un agitateur de laboratoire. Perméabilisez ensuite les cellules avec 200 μL d’Octoxinol 9 à 0,1 % pendant 10 min. Lavez doucement les cellules trois fois avec 30 ml de solution bloquante à 5 % pendant 5 minutes chacune sur un agitateur de laboratoire. Bloquer les cellules dans 30 mL de solution bloquante fraîche à 5 % pendant 1 h.
- Incubation avec des anticorps
- Incuber une préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris (1:500) et l’autre préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris (1:500) et un anticorps polyclonal anti-53BP1 de lapin (1:500) pendant la nuit à 4 °C.
- Après l’incubation, laver doucement les cellules 3 fois avec 30 ml de solution bloquante à 2 % toutes les 5 minutes sur un agitateur de laboratoire.
- Retirez la solution bloquante et incubez la première préparation des cellules avec un anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué à Alexa488 (1:500) et la deuxième préparation des cellules avec un anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué à Alexa488 (1:500) et un anticorps secondaire anti-lapin d’âne conjugué à Alexa555 (1:500) pendant 1 h à température ambiante.
- Milieu de montage : Placez la lame avec les cellules dans un bol et lavez doucement les cellules trois fois avec 30 ml de PBS toutes les 5 minutes sur un agitateur de laboratoire. Retirez le PBS et montez les cellules avec un milieu de montage contenant du 4,6-diamidino-2-phénylindole. Placez avec précaution une lamelle sur le support de montage afin qu’aucune bulle d’air ne s’incruste. Attendre au moins 3 h le durcissement du milieu de montage avant d’analyser les cellules par microscopie à fluorescence.
3. Analyse des foyers γH2AX et 53BP1
- Microscopie à fluorescence : Analysez les foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux cellulaires à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI, Alexa 488 et Cy3 pendant l’imagerie à un grossissement d’objectif de 100X. Enregistrez des images avec un appareil photo et traitez-les avec un logiciel d’imagerie approprié.
