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1. Production de 15N, 13C-Tau (Figure 1)
- Plasmide d’expression recombinant T7 de pET15b-Tau en cellules bactériennes Escherichia coli compétentes BL21(DE3).
REMARQUE : l’ADNc codant pour l’isoforme Tau la plus longue (441 résidus d’acides aminés) est cloné entre les sites de restriction NcoI et XhoI dans le plasmide pET15b.
- Mélangez doucement 50 μl de cellules BL21(DE3) compétentes, formant 1-5 x 107 colonies par μg d’ADN plasmidique, avec 100 ng d’ADN plasmidique dans un tube en plastique de 1,5 ml.
note: Les souches bactériennes optimisées pour l’expression de l’ADNc eucaryotes ne sont pas essentielles à la production de Tau humain.
- Placez le mélange cellulaire sur de la glace pendant 30 min, puis un choc thermique pendant 10 secondes à 42 °C. Remettez le tube sur la glace pendant 5 minutes et ajoutez 1 ml de milieu LB (Luria-Bertani) à température ambiante. Incuber la suspension bactérienne à 37 °C pendant 30 min sous une légère agitation.
- Étaler uniformément à l’aide d’une boucle d’inoculation 100 μl de suspension cellulaire sur une plaque de gélose de milieu LB contenant 100 μg/ml d’antibiotique ampicilline.
- Incuber la plaque de sélection pendant 15 heures à 37 °C.
- Maintenir la plaque de sélection à 4 °C jusqu’à l’étape de culture, pendant un maximum de 2 semaines environ.
REMARQUE : un stock de glycérol de culture bactérienne (50 % de glycérol), stocké à -80 °C, peut être préparé pour commencer la culture à un stade ultérieur.
- Ajouter 1 ml de 1 M de MgSO4, 1 ml de 100 mM de CaCl2, 10 ml de complément vitaminique 100x MEM, 1 ml d’ampicilline à 1 L de sels M9 autoclavés (6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl).
note: Un précipité blanc se formera lors de l’ajout de la solution de CaCl2 aux sels M9 qui se dissipera rapidement.
- Solubiliser 300 mg de milieu 15N, 13C-complet, 1 g de 15NH4Cl et 2 g de 13C6-glucose dans 10 ml de milieu M9. Stérilisez la solution isotopique à l’aide d’un filtre de 0,2 μm, directement dans le milieu M9.
- Suspendre, à l’aide d’une boucle d’inoculation, une colonie de bactéries transformées par pET15b-Tau à partir de la plaque de sélection dans 20 ml de milieu LB complété par 100 μg/ml d’ampicilline.
- Incuber le milieu inoculé à 37 °C pendant environ 6 heures.
- Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) sur 1 ml d’une dilution d’une culture bactérienne d’une dilution d’un ton dix dans une cuvette de spectromètre en plastique.
note: La turbidité de la culture bactérienne correspondant à OD600 de 3,0-4,0 indique que la phase de croissance de saturation est atteinte.
- Ajouter 20 ml de la culture LB saturée à 1 L de milieu de croissance M9 complété par de l’ampicilline (concentration finale de 100 μg/ml), dans une fiole de culture à chicanes en plastique Erlenmeyer de 2 L.
- Placez le ballon de culture dans un incubateur programmable réglé à 10 °C et 50 tr/min. Programmez l’incubateur pour qu’il passe à 200 tr/min et 37 °C tôt le matin du lendemain.
- Mesurer OD600 sur 1 ml de culture bactérienne dans une cuvette de spectromètre en plastique. Ajouter 400 μl de solution mère d’IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) (maintenue à -20 °C) lorsque l’OD600 atteint une valeur d’environ 1,0 pour induire l’expression de la protéine Tau recombinante.
- Poursuivre l’incubation à 37 °C pendant 3 heures supplémentaires. Recueillir les cellules bactériennes par centrifugation à 5 000 x g pendant 20 min.
- Congelez la pastille bactérienne à -20 °C. Conservez-la congelée jusqu’à l’étape de purification, pendant une période prolongée si nécessaire.
2. Purification de 15N, 13C-Tau (Figure 2)
- Tampons de purification par échange cationique (CEX) en autoclave à 121 °C sous 15 psi pendant 20 min. Stocker les tampons à 4 °C.
- Décongelez la pastille de cellules bactériennes et remettez-la complètement en suspension dans 45 ml de tampon d’extraction CEX A (50 mM tampon NaPi pH 6,5, 1 mM EDTA) fraîchement complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 1x (1 comprimé) et DNAseI (2 000 unités).
- Perturbez les cellules bactériennes à l’aide d’un homogénéisateur à haute pression à 20 000 psi. 3-4 passages sont nécessaires. Centrifugeuse à 20 000 x g pendant 40 min pour éliminer les matériaux insolubles.
- Chauffer l’extrait de cellules bactériennes pendant 15 min à 75 °C au bain-marie.
REMARQUE : un précipité blanc est observé au bout de quelques minutes.
- Centrifugez à 15 000 x g pendant 20 min et maintenez le surnageant contenant la protéine Tau thermostable.
- Conserver à -20 °C jusqu’à l’étape de purification suivante si nécessaire.
- Effectuer une chromatographie échangeuse de cations sur une résine CEX forte emballée dans une colonne de lit de 5 ml à l’aide d’un système de chromatographie liquide protéique rapide (FPLC) (Figure 3 A).
- Réglez le débit à 2,5 ml/min.
- Équilibrer la colonne dans le tampon CEX A
- Chargez les 60 à 70 ml d’extrait chauffé contenant Tau à l’aide d’une pompe d’échantillonnage, ou bien de la pompe A, selon le système. Prélever le flux pour analyse afin de vérifier que la protéine Tau se lie efficacement à la résine (voir 2.8).
- Lavez la résine avec un tampon CEX A jusqu’à ce que l’absorbance à 280 nm soit revenue à la valeur de référence.
- Éluer Tau de la colonne à l’aide d’un gradient de NaCl en trois étapes obtenu par une augmentation progressive du tampon CEX B (tampon CEX A avec 1 M de NaCl). Programmez le FPLC comme suit : la première étape du gradient vers 25 % de tampon CEX B dans 10 volumes de colonne (CV) pour atteindre 250 mM de NaCl, la deuxième étape vers 50 % de tampon CEX B dans 5 CV pour atteindre 500 mM de NaCl, et la troisième étape vers 100 % de tampon CEX B dans 2 CV pour atteindre 1 M de NaCl. Prélever des fractions de 1,5 ml pendant les étapes d’élution.
- Analyser 10 μl des fractions collectées lors de l’étape d’élution par coloration SDS-PAGE (12 % SDS-gel acrylamide) et Coomassie (Figure 3 A). Vérifiez également l’étape de chargement sur la colonne en analysant 10 μl de l’écoulement.
- Choisissez les fractions contenant Tau et regroupez ces fractions pour l’étape suivante.
- Effectuez un échange de tampon sur des fractions regroupées contenant Tau (Figure 3 B).
- Equilibérez une colonne de dessalage de 53 ml de lit de résine G25 (26 x 10 cm) dans 50 mM de bicarbonate d’ammonium (tampon volatil) à l’aide d’un système FPLC.
- Réglez le débit à 5 ml/min. Injectez l’échantillon Tau sur la colonne via une boucle d’injection de 5 ml. Collecter les fractions correspondant au pic d’absorption à 280 nm.
- Répétez l’injection 3 à 4 fois, en fonction du volume de la piscine CEX initiale.
- Calculez la quantité de protéine Tau purifiée en utilisant l’aire du pic du chromatogramme à 280 nm (1 mg de Tau correspond à 140 mAU*ml).
note: Le coefficient d’extinction de la protéine Tau à 280 nm est de 7 550 M-1 cm-1. Tau ne contient aucun résidu de Trp.
- Mettez en commun toutes les fractions Tau.
- Aliquote l’échantillon dans des tubes contenant l’équivalent de 1 à 5 mg de Tau. Choisissez ces tubes de manière à ce que le volume de solution soit faible par rapport au volume du tube (par exemple 5 ml de solution dans un tube de 50 ml).
- Percez des trous dans les bouchons des tubes à l’aide d’une aiguille. Congelez les échantillons de Tau à -80 °C.
- Lyophiliser des échantillons de Tau. La protéine Tau lyophilisée peut être conservée à -20 °C pendant de longues périodes.
3. Phosphorylation in vitro de 15N-Tau
- Dissoudre 5 mg de Tau lyophilisé dans un tampon de phosphorylation de 500 μl (50 mM Hepes·KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
- Ajouter 2,5 mM d’ATP (25 μl de solution mère de 100 mM maintenue à -20 °C), 1 mM de DTT (1 μl de solution mère de 1 M maintenue à -20 °C), 1 mM d’EGTA (2 μl d’une solution mère de 0,5 M), 1x cocktail d’inhibiteur de protéase (25 μl d’un stock 40x obtenu par dissolution de 1 comprimé dans 1 ml de tampon de phosphorylation) et 1 μM de His-ERK2 activé (250 μl dans un tampon de conservation 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl et 10 % de glycérol, stockés à -80 °C) dans un volume total d’échantillon de 1 ml.
note: Le His-ERK2 activé peut être préparé en interne par phosphorylation avec la kinase MEK.
- Incuber 3 h à 37 °C.
- Chauffer l’échantillon à 75 °C pendant 15 min pour inactiver la kinase ERK.
- Centrifuger à 20 000 x g pendant 15 min. Recueillir et conserver le surnageant.
- Dessaler l’échantillon de protéines en bicarbonate d’ammonium de 50 mM à l’aide d’une colonne de 3,45 ml de lit rempli de résine G25 (1,3 x 2,6 cm), adaptée à un échantillon de 1 ml.
- Exécutez une SDS-PAGE à 12 % avec 2,5 μl de l’échantillon de protéine pour vérifier à la fois son intégrité et sa phosphorylation efficace (Figure 4).
- Lyophiliser l’échantillon de Tau phosphorylé. Conservez la poudre à -20 °C.
4. Acquisition des spectres RMN (Figure 5)
- Solubiliser 4 mg de 15N, 13C ERK-phosphorylée-Tau lyophilisée dans un tampon RMN de 400 μl (50 mM de NaPi ou 50 mM de Tris-d11 deutéré. Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA et 1 mM DTT).
- Ajouter 5 % de D2O pour le verrouillage de champ du spectromètre RMN et 1 mM de TMSP (sel de sodium acide 3-(triméthylsilyl)propionique-2,2,3,3-d)) comme référence de signal RMN interne. Ajouter 10 μl d’une solution mère 40x d’un cocktail complet d’inhibiteurs de protéase.
- Transférez l’échantillon dans un tube RMN de 5 mm à l’aide d’une seringue électronique munie d’une longue aiguille ou d’une pipette Pasteur. Fermez le tube RMN à l’aide du piston. Éliminez toutes les bulles d’air coincées entre le piston et le liquide par des mouvements du piston.
- Placez le tube RMN dans une cuisse. Ajustez sa position verticale dans la toupie à l’aide de la jauge appropriée à la tête de sonde RMN utilisée, de sorte que la majeure partie de la solution d’échantillon se trouve à l’intérieur de la bobine RMN.
- Démarrez le flux d’air : cliquez sur lift dans la fenêtre du système de contrôle magnétique. Placez soigneusement le cône avec le tube dans le flux d’air en haut de l’alésage de l’aimant. Arrêtez le flux d’air (click lift) et laissez le tube descendre en place à l’intérieur de la tête de sonde dans l’aimant.
- Réglez la température à 25 °C (298 K).
- Effectuez un réglage et une correspondance semi-automatiques de la tête de sonde pour optimiser la transmission de puissance. Tapez atmm sur la ligne de commande.
- Verrouillez la fréquence du spectromètre à l’aide du signal D2O de l’échantillon enregistré sur le canal deutérium. Cliquez sur le verrou dans la fenêtre du système de contrôle magnétique.
- Démarrer la procédure de calage pour optimiser l’homogénéité du champ magnétique à la position de l’échantillon. Tapez topshim gui sur la ligne de commande pour ouvrir la fenêtre shim. Cliquez sur Démarrer dans la fenêtre de cale. Vérifiez la valeur résiduelle de la variation standard B0 pour vérifier que les cales sont optimales (moins de 2 Hz est bon).
- Calibrer le paramètre p1 (longueur d’une impulsion radiofréquence de proton en μsec), qui est nécessaire pour obtenir une rotation de 90° des spins des protons. Visez l’impulsion à 360° en utilisant un spectre 1D de protons d’eau (Figure 6).
- Ajustez le décalage de fréquence en réglant le paramètre o1 (en Hz) sur la fréquence de l’eau du proton dans le spectre 1D (Figure 6).
- Commencer l’acquisition d’un spectre de protons 1D (séquence d’impulsions avec séquence de watergate pour la suppression du signal d’eau, par exemple, zggpw5) pour vérifier les signaux de l’échantillon (Figure 7). Adaptez le nombre de balayages à la concentration relative en protéines. Tapez zg sur la ligne de commande pour démarrer l’acquisition.
