La technique de spectroscopie de dichroïsme circulaire pour étudier les interactions ADN-protéines

Résumé

Source : Arya, V., et al. Spectroscopie CD pour étudier les interactions ADN-Protéine. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo démontre la technique de spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) pour étudier les changements conformationnels se produisant dans l’ADN en présence d’une protéine de remodelage de la chromatine dépendante de l’ATP. Les changements dans les spectres CD mesurés en présence et en absence d’hydrolyse de l’ATP indiquent l’importance de l’ATP dans la capacité du remodeleur à induire des changements conformationnels dans l’ADN lié.

Protocole

1. Concentration de travail des composants de la réaction

1. Préparez fraîchement les concentrations de travail des tampons pour la CD et maintenez-les à 4 °C avant de mettre en place les réactions.
   note: Pour les réactions CD décrites dans cet article, les concentrations de travail des composants sont les suivantes : Tampon phosphate de sodium (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, Protéine 1 μM, MgCl₂ 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. Choix et préparation des cuvettes CD

1. Collectez des spectres de CD dans des cuvettes en quartz à haute transparence. Utilisez des cuvettes rectangulaires ou cylindriques.
   note: Une cuvette en quartz CD (volume nominal de 0,4 mL, longueur de trajet de 1 mm) a été utilisée pour toutes les réactions décrites dans cet article.
2. Utilisez une solution de nettoyage de cuvette pour nettoyer la cuvette. Ajouter une solution de nettoyage de cuvette à 1 % dans de l’eau pour obtenir 400 μL de solution, la verser dans la cuvette et l’incuber à 37 °C pendant 1 h.
3. Lavez la cuvette à l’eau plusieurs fois pour nettoyer la cuvette. Faites un balayage de l’eau ou du tampon dans la cuvette pour vérifier si elle est propre.
   note: L’eau ou le tampon doit donner une lecture de l’ordre de 0 à 1 mdeg.

3. Préparation des protéines et de l’oligonucléotide d’ADN

1. Maintenez le volume de la protéine en dessous de 50 μL dans la réaction afin de minimiser les quantités de composants tampons qui provoquent parfois la formation de pics ambigus. Gardez les protéines sur la glace tout au long de l’expérience pour éviter toute dégradation.
2. Utilisez des oligonucléotides d’ADN purifiés par PAGE dans les réactions.
   note: Dans les réactions décrites ici, l’ADN a été utilisé à la fois sous forme native et sous forme refroidie thermiquement (refroidissement rapide (FC) et refroidissement lent (SC)). Le refroidissement rapide favorise la liaison intramoléculaire dans l’ADN, produisant davantage de structures secondaires. En revanche, le refroidissement lent favorise la liaison intermoléculaire dans l’ADN, ce qui entraîne moins de structures secondaires.
3. Pour un refroidissement rapide, chauffez DNA à 94 °C pendant 3 min sur le bloc chauffant et refroidissez-le immédiatement sur de la glace. Pour un refroidissement lent, chauffez DNA à 94 °C pendant 3 min et laissez-le refroidir à température ambiante à raison de 1 °C par minute.

4. Mise en place d’expériences de contrôle pour enregistrer les spectres de référence

1. Maintenez le volume de réaction à 300 μL dans toutes les réactions. Mettre en place un total de 5 réactions de référence dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL, une par une, comme suit : i) Tampon + Eau ; ii) Tampon + MgCl₂ + ATP + Eau ; iii) Tampon + MgCl₂ + ATP + Protéine + Eau ; iv) iii + EDTA ou ADAADiN ; v) Tampon + Protéines + Eau.

5. Mise en place des expériences pour l’enregistrement des spectres de CD

1. Mettre en place un total de 5 réactions, une par une, dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL comme suit : i) Tampon + ADN + Eau ; ii) Tampon + ADN + MgCl₂ + ATP + Eau ; iii) Tampon + ADN + MgCl₂ + ATP + Protéine + Eau ; iv) iii + EDTA ou ADAADiN ; v) Tampon + ADN + Protéine + Eau.

6. Balayage de l’enregistrement

1. Allumez le gaz et allumez le spectromètre CD.
2. Allumez la lampe après 10-15 min. Allumez le bain-marie et réglez la température du support à 37 °C.
3. Ouvrez le logiciel CD spectrum.
   1. Réglez la température à 37 °C.
   2. Réglez la plage de longueurs d’onde sur 180 - 300 nm.
   3. Réglez le temps par point sur 0,5 s.
   4. Réglez le numéro de numérisation sur 5.
   5. Cliquez sur Pro-Data Viewer, créez un nouveau fichier et renommez-le avec des détails sur l’expérience et la date.
4. Conservez tous les composants de la réaction sur de la glace pour éviter toute dégradation. Faites les lignes de base et les réactions, une par une, dans des tubes à centrifuger et mélangez-les par pipetage. Transférez soigneusement le mélange réactionnel dans la cuvette, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.
5. Si vous effectuez une expérience dans le temps, incubez les réactions à 37 °C pendant la durée requise et effectuez le balayage. Ajoutez de l’EDTA au tampon contenant l’ADN, l’ATP, le Mg⁺² et la protéine pour arrêter l’hydrolyse de l’ATP.
6. Augmenter la concentration d’EDTA et son temps d’incubation pour inhiber complètement l’activité de l’ATPase.
7. Soustrayez les lignes de base des réactions correspondantes dans le logiciel (par exemple, soustrayez la réaction 1 de la ligne de base 1). Lissez les données soit dans le logiciel de spectre CD, soit dans le logiciel de traçage de données. Tracez les données dans le logiciel de traçage de données.
   note: En soustrayant les lignes de base des réactions correspondantes, on obtient les spectres CD nets de l’ADN uniquement.

7. Analyse et interprétation des données

1. Utilisez la formule donnée par eq (1) pour convertir les valeurs obtenues en millidegrés en ellipticité moyenne du résidu.
   

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sel disodique d’adénosine 5′-triphosphate hydraté	Sigmaaldrich	A2383
Cuvette CD Quartz	STARNA	21-Q-1
Spectromètre Chirascan V100 CD	Photophysique appliquée	non disponible
EDTA Sel disodique dihydraté	SRL	Référence 43272
Solution de nettoyage Hellmanex III	Hellma	Référence : 9-307-011-4-507
Chlorure de magnésium hexahydraté	Fisher scientifique	M33-500
Phosphate de sodium dibasique anhydre	Fisher scientifique	S374-500
Phosphate de sodium monobasique monohydraté	Fisher scientifique	S369-500
Lecteur de microplaques Synergy HT	BioTek	non disponible
Base Tris	Fisher scientifique	BP152-500