Immunodosage direct basé sur la spectroscopie Raman pour détecter un antigène spécifique

Résumé

Source : Hanson, C., et al. Fabrication d’une plate-forme d’immunodosage par spectroscopie UV-Vis et Raman. J. Vis. Exp.(2016).

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode d’immunodosage direct basée sur la spectroscopie Raman pour détecter des antigènes cibles spécifiques. Les anticorps, qui sont adsorbés à la surface de nanoparticules d’or attachées à des sondes Raman, interagissent avec les antigènes cibles et produisent un spectre Raman spécifique, qui est ensuite détecté.

Protocole

1. Préparer les sondes UV-Vis/Raman

1. Préparer une solution d’AuNP nue
   1. Préparez une solution de 2 ml d’AuNPs avec une concentration d’environ 1 x 1011 particules par ml.
      1. Si les AuNP doivent être concentrés, remplissez les tubes de centrifugation à faible liaison avec 2 000 μl de base d’AuNP et centrifugez à 5 000 x g pendant 20 min ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Retirer le surnageant par pipetage, en prenant soin de ne pas déranger la pastille d’AuNP.
      2. Combinez les solutions AuNP restantes dans un seul tube et estimez la concentration en obtenant une mesure UV-Vis et en comparant les valeurs aux concentrations connues, car il s’agit d’une relation linéaire.
2. Déterminer le rapport d’étiquetage du rapporteur Raman approprié
   1. Préparez une solution de travail du rapporteur Raman dissous dans du méthanol. Cette concentration dépendra du rapporteur utilisé. Dans ce travail, préparer de l’iodure de 3,3'-diéthylthiatricarbocyanine (DTTC) à une solution de travail de 200 μM.
   2. En supposant un volume final de 100 μl pour chaque puits, ajoutez suffisamment de solution de rapporteur de travail dans chaque puits de la première rangée d’une plaque de 96 puits de sorte que les concentrations du rapporteur Raman varient de 0,2 μM à 10 μM. Ajoutez suffisamment d’eau de qualité HPLC dans chaque puits pour que le volume soit de 80 μl. Ajoutez 20 μl d’AuNP dans chaque puits, ce qui constitue un volume final de 100 μl pour chaque puits. Le tableau 1 en donne un exemple.
   3. Mesurez les spectres UV-Vis de 400 à 700 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à lecture de plaques. La concentration appropriée est la concentration la plus élevée avec des pics définis pour les spectres UV-Vis. Répéter l’étape 2.2.2 à des concentrations croissantes jusqu’à ce que le rapport de concentration le plus élevé de rapporteurs Raman par rapport aux AuNP soit trouvé.
      note: Le colorant ainsi que la forme, la taille et le fabricant de l’AuNP influencent la concentration appropriée. Par conséquent, les étapes énumérées doivent être évaluées et modifiées en fonction des composants utilisés. Ce protocole impliquait l’utilisation d’un colorant chargé positivement. Ainsi, la liaison entre l’AuNP et le rapporteur a été améliorée en utilisant des AuNP chargées négativement. Cela a été fait en utilisant des AuNP coiffés en citrate. Voir la section Discussion pour plus de détails.
3. Liaison du rapporteur Raman et du PEG-Ab à l’AuNP
   1. Préparez deux lots de 1,5 ml d’AuNP et de rapporteur Raman à la concentration précédemment déterminée, en permettant au rapporteur Raman de se lier aux AuNP pendant 30 minutes à température ambiante.
   2. Ajoutez l’anticorps pégylé (PEG-Ab) à un lot de la solution de rapporteur AuNP et Raman pour créer un rapport de 200:1 entre les anticorps et les particules. Cette solution concernera les échantillons de test. Dans un tube de microcentrifugation séparé, ajoutez l’antigène pégylé à l’autre lot de la solution rapporteure AuNP et Raman à un rapport de 200:1 entre les anticorps et les particules à utiliser comme témoin. Incuber les solutions pendant 30 min à température ambiante.
      REMARQUE : Le rapport entre les anticorps et les particules sera spécifique aux AuNP et au colorant utilisé et doit être optimisé pour chaque cas individuel. L’objectif ici est d’avoir le rapport d’anticorps le plus élevé auquel les sondes AuNP peuvent se lier tout en empêchant l’agrégation des particules. Utilisez l’équation suivante pour déterminer les volumes appropriés à additionner :
      Volumes à ajouter de chaque composant (ml) Concentration finale DTTC (mM) Solution de travail DTTC (200 mM) AuNP Eau 0,2 0,1 20 79,9 0,6 0,3 20 79,7 1 0,5 20 79,5 deux 1.0 20 79 5 2.5 20 77,5 7 3.5 20 76,5 10 5.0 20 75

      2. Préparation de la plaque d’immunodosage

      1. Lier l’antigène souhaité à la plaque d’immunoessai.
         1. Préparez suffisamment d’antigènes dilués (50 μg/ml) pour remplir les puits de polystyrène. Vortex la solution et ajoutez immédiatement la solution dans les puits de la plaque. Laisser l’antigène se lier aux plaques pendant 1 heure à température ambiante.
      2. Laver les antigènes non liés.
         1. Retirez l’excès de solution d’antigène en la jetant dans un récipient d’élimination et en frappant l’assiette contre une table recouverte d’essuie-tout.
         2. Ajoutez du TBST dans les puits pour laver la surface, puis retirez le lavage de la même manière que indiqué précédemment. Répétez cette étape deux fois de plus.
      3. Bloquez les sites de liaison restants sur la plaque pour éviter les liaisons non spécifiques.
         1. Ajouter 70 μl de solution bloquant le HSA dans chaque puits de la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 min.
         2. Retirez et rincez la plaque en suivant la même procédure que celle spécifiée à l’étape 3.2. Couvrez la plaque et rangez-la au sec à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée ultérieurement.
      4. Fonctionnaliser la plaque d’immunodosage.
         1. Ajouter 70 μl des nanoparticules de sonde préparées dans la section 2 à la première colonne d’une plaque de 96 puits et diluer les colonnes suivantes en utilisant une dilution en série de 1:2. Laissez la plaque incuber pendant au moins 1 heure. Un exemple de préparation de la plaque d’immunodosage est donné à la figure 1.
         2. Lavez la plaque avec du TBST cinq fois comme indiqué à l’étape 3.2, en veillant à éliminer les AuNP de manière appropriée. Après le lavage final, ajoutez 70 μl de 1x PBS dans chaque puits et couvrez avec une plaque seal.
            REMARQUE : Les échantillons de contrôle doivent être clairs. Si la liaison non spécifique s’est produite, les échantillons de contrôle auront une couleur similaire à celle des échantillons d’essai.
      5. Testez la sensibilité du test par spectroscopie UV-Vis et Raman.
         1. Pour chaque puits, mesurez les spectres UV-Vis allant de 400 à 700 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à lecture de plaques.
         2. À l’aide d’un microscope Raman inversé, focalisez l’objectif sur la surface du puits qui contient les sondes AuNP. Obtenez les spectres Raman du puits. Collecter un spectre allant de 1 800 ^cm-1 à 400 ^cm-1. Répétez cette étape pour tous les puits.
         3. À l’aide d’un logiciel spectral approprié, effectuez une correction de base polynomiale d’ordre 11 pour les spectres Raman et une correction polynomiale^d’ordre 3 pour les spectres UV-Vis.
         4. À l’aide d’un logiciel spectral approprié, normalisez les spectres Raman et UV-Vis. Définissez la valeur maximale sur 1 et mettez à l’échelle toutes les autres valeurs en conséquence. Pour normaliser les spectres Raman, sélectionnez un pic de polystyrène unique et définissez-le sur 1, puis mettez à l’échelle toutes les autres valeurs en conséquence.
         5. À l’aide d’un logiciel spectral approprié, effectuez l’intégration des pics pour chaque spectre. Pour les spectres Raman, le pic représentant le rapporteur Raman doit se trouver dans une région dépourvue de pics de polystyrène. Pour effectuer l’intégration des pics, spécifiez les limites intégrales du pic souhaité et enregistrez la surface du pic souhaitée pour tous les échantillons, y compris les commandes.
         6. Tracez la zone de pic moyenne d’intérêt en fonction du logarithme de la concentration d’AuNP avec des barres d’erreur pour chaque point indiquant son écart-type associé. Ajustez ces points d’étalonnage à une courbe logistique à 4 paramètres.
         7. Déterminez la valeur moyenne du blanc en faisant la moyenne de la zone du pic d’intérêt pour un échantillon blanc. Déterminer l’écart-type de ces aires ; Il s’agit de l’écart-type de l’ébauche.
         8. Pour le même pic analysé à l’étape précédente, déterminez l’écart-type de cette zone de pic pour la concentration la plus faible.
         9. Calculez la limite du blanc et la limite inférieure de détection comme indiqué dans la section Résultats représentatifs. Utilisez ces valeurs avec les courbes d’étalonnage 4PL pour déterminer le LLOD en termes de concentration d’AuNP.

Résultats

Graphique 1. Plaque d’immunodosage préparée. Image d’une plaque d’immunodosage préparée. Les rangées A à E sont des échantillons d’essai, tandis que les rangées F à H sont des échantillons de contrôle. La colonne 1 contient les nanoparticules non diluées et chaque colonne suivante a la moitié de la concentration des sondes AuNP.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nanoparticule d’or 60 nm	Ted Pella, Inc.	Référence 15708-6	Il s’agit de nanoparticules d’or recouvertes de citrate. Veuillez consulter la discussion pour la relation entre le rapporteur Raman et la charge de surface AuNP et son importance pour la sélection appropriée de l’AuNP et/ou du rapporteur Raman.
Bicarbonate de sodium	Fisher Scientific	S233-500
méthanol	Pharmco-Aaper	Référence 339000000
Solution saline tamponnée au tris (10x) pH 7,5	Scy Tek	TBD999
Unité de filtration par le haut de la bouteille	VWR	Référence 97066-202
Tween 20 (polysorbate 20)	Scy Tek	TWN500	Utilisé comme agent émulsifiant pour les étapes de lavage.
Concentré salin tamponné au phosphate 10x, pH 7,4	Scy Tek	PBD999 (en
Tube Protéiné LoBind 2.0 ml	Tubes Eppendorf	22431102	Les tubes LoBind empêchent la liaison des protéines et des AuNPs aux surfaces des tubes.
Tube Protéiné LoBind 0,5 ml	Tubes Eppendorf	22431064	Les tubes LoBind empêchent la liaison des protéines et des AuNPs aux surfaces des tubes.
Dispositifs de microplaques UniSeal	GE Soins de santé	Référence 7704-0001	Utilisé pour sceller et stocker des plaques fonctionnalisées.
Plaque de dosage, avec couvercle à faible évaporation, fond plat à 96 puits	Costar	Référence 3370
Eau de qualité HPLC	Sigma Aldrich	Référence 270733-4L
Iodure de 3,3′-diéthylthiatricarbocyanine (DTTC)	Sigma Aldrich	Référence 381306-250MG	Reporter Raman
mPEG-Thiol, MW 5 000 - 1 gramme	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5 000 - 1 gramme	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA a une extrémité NHS.
IgG de souris, contrôle de la molécule entière	Thermo Fisher Scientific	Référence 31903	antigène
Anticorps secondaire adsorbé croisé anti-IgG de souris (H+L) de chèvre	Thermo Fisher Scientific	Référence 31164	anticorps
Solution de blocage de l’albumine sérique humaine	Sigma Aldrich	A1887-1G	L’albumine sérique bovine peut être utilisée à la place.
Spectrophotomètre UV-Vis	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
Spectrophotomètre UV-Vis	BioTek	Synergie 2
Unité de microscope Raman inversé de 785 nm construite en interne	n/a	n/a	Un microscope Raman inversé est le meilleur pour une mise au point correcte sur la surface de la plaque du puits. Sinon, un très faible grossissement sera utilisé en raison de la hauteur de la plaque à 96 puits. Un système construit à l’interne a été utilisé, car il était moins cher que d’acheter auprès d’un fournisseur. Cependant, tout système de microscope Raman inversé disponible dans le commerce peut être utilisé.