Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Isolement des monocytes humains primaires par sélection immunomagnétique négative
- Prélever 40 ml de sang total humain frais (provenant d’un patient VIH+ ou d’un témoin sain) dans quatre tubes à vide de 10 ml d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (10 ml de sang par tube). À l’aide de techniques stériles sous une enceinte de biosécurité, transférez les 40 ml de sang dans un tube conique en propylène de 50 ml.
- En suivant le protocole du fabricant pour la trousse d'isolement des monocytes humains sélectionnée (tableau des matières), ajoutez 2 ml de cocktail d'isolement des monocytes, fourni dans la trousse, dans le tube de sang. Des billes magnétiques vortex, également fournies dans le kit, pendant 30 s, et ajoutent 2 mL dans le tube de sang.
- S’il y a moins de 40 ml de sang disponible, réduisez le nombre de réactifs ajoutés. Pour mélanger la solution, pipeter de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique en plastique de 25 mL et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Séparez le mélange sanguin également dans quatre tubes de 50 mL et ajoutez 30 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile contenant 1 mM d’EDTA dans chaque tube. Mélanger par pipetage de haut en bas avec une pipette sérologique en plastique de 25 ml.
- Placez les tubes dans des supports magnétiques pendant 10 minutes pour retirer les billes magnétiques conjuguées aux anticorps. Utilisez quatre supports magnétiques simultanément, un pour chaque tube, afin de permettre des temps d’incubation et d’isolement constants pour chaque échantillon de sang.
- Prélevez le contenu au centre de chaque tube, à l’aide d’une pipette, pendant qu’il est encore dans les supports d’aimants. Veillez à ne pas prélever de globules rouges (pas plus de 10 % du volume de départ de 10 ml) et placez le contenu dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 ml.
- Ajouter 500 μL de billes magnétiques vortex dans chaque tube de 50 mL. Pipeter de haut en bas avec une pipette de 25 mL et incuber à RT pendant 5 min. Ensuite, placez les tubes dans des supports magnétiques pendant 5 min.
- Transférez soigneusement le contenu du centre de chaque tube dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 ml. Placez directement chaque nouveau tube de 50 ml dans les supports magnétiques pendant 5 min.
- Transférez soigneusement le contenu du centre de chaque tube dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 ml. Faites tourner tous les nouveaux tubes de 50 mL à 300 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et mettez en suspension les quatre pastilles de cellules dans un total de 10 mL de PBS stérile.
- Comptage des cellules par exclusion au bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre.
REMARQUE : 8-20 x 106 cellules sont généralement obtenues à partir de 40 mL de sang total.
2. Culture de monocytes humains primaires
- À l’aide d’un bain-marie à 37 °C, un milieu chaud RPMI 1640 sans sérum complété par 1 % de pénicilline-streptomycine (pen/streptomycine), et (tout en continuant à utiliser des techniques stériles sous une enceinte de biosécurité) remettre en suspension les monocytes isolés dans ce milieu à une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
- Ajouter 1 mL de cellules remises en suspension dans chaque puits d’une plaque à 6 puits ou dans une boîte de 35 mm (le nombre final de cellules doit être de 1 x 106 cellules/plaque) et placer dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2. Attendez 0,5 à 1,0 h pour que les cellules adhèrent.
- À l’aide d’un bain-marie à 37 °C, du sérum fœtal bovin (FBS) chaud inactivé par la chaleur (HI). Ajouter 100 μL (concentration finale de 10 %) de FBS dans chaque plaque. Ajoutez des facteurs de croissance aux cellules pour favoriser la différenciation des macrophages.
- Amorcer les macrophages pour un phénotype de type M1 en ajoutant 25 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) au milieu. Préparez les macrophages pour un phénotype de type M2 en ajoutant 50 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) à media.
note: Le GM-CSF et le M-CSF permettent tous deux la différenciation des monocytes en un phénotype général de macrophage (M0) tout en préparant les cellules pour M1 ou M2, respectivement.
