Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement et culture PMC par lavage intrapéritonéal
- Isolement de la PMC par lavage intrapéritonéal
- Avant l’isolement de la cellule, préparez les matériaux énumérés au tableau 1.
- Utilisez des souris mâles âgées de 8 à 14 semaines pour l’isolement de la PMC. Euthanasier une souris par inhalation de CO2, et confirmer la mort par perte de réflexes. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 % et fixez-la sur un bloc de mousse à l’aide d’épingles (côté dorsal vers le bas). Retirez la peau ventrale de la souris à l’aide de ciseaux à bord émoussé. Évitez d’endommager la cavité péritonéale.
note: Nous utilisons généralement ce protocole pour les souris ayant un patrimoine génétique de souche C57BL/6N.
- Injecter 7 ml de milieu glacé RPMI et 5 ml d’air dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’une aiguille de 27 g. Enfoncez soigneusement l’aiguille dans le péritoine et ne perforez aucun organe. Utilisez un endroit dans la région de la graisse épididymaire pour réduire le risque de perforation d’organe.
- Après l’injection, secouez la souris pendant 1 minute pour détacher les cellules péritonéales dans le milieu RPMI. Ne secouez pas trop fort la souris, pour éviter d’endommager les organes internes et de contaminer la cavité péritonéale avec le sang.
- Réutilisez la seringue de 10 ml en l’équipant d’une nouvelle canule de 20 G. Déplacez les organes internes d’un côté en inclinant le bloc de mousse et en le tapotant doucement sur le banc pour faciliter l’aspiration moyenne de l’autre côté. Insérez une aiguille de 20 G, biseautez vers le haut et aspirez le liquide de l’abdomen doucement et lentement (~0,5 mL/s) pour éviter l’obstruction par les organes internes. Prélevez autant de liquide que possible (généralement 5 à 6 ml).
- Retirez l’aiguille de la seringue et transférez la suspension cellulaire recueillie dans un tube de collecte sur de la glace. Jetez un tube d’échantillon s’il y a une contamination sanguine visible.
- Centrifuger les tubes avec la suspension cellulaire à ~300 x g pendant 5 min. Sous une hotte stérile, aspirez le surnageant. Pour chaque souris, mélanger les granules d’échantillon dans 4 mL de milieu PMC froid (4 à 10 °C) et transférer la suspension cellulaire dans une fiole deculture de 25 cm 2. Ajouter les facteurs de croissance IL-3 et SCF aux concentrations finales de 10 ng/mL et 30 ng/mL, respectivement. Placez le ballon contenant les cellules dans un incubateur (37 °C et 5 % CO2) et incubez pendant ~48 h jusqu’à la procédure suivante.
- La culture des PMC
- Jour 2 (~48 h après l’isolement) : Changement moyen
- Pour prélever les cellules surnageantes et non adhérentes (érythrocytes et cellules mortes), aspirez le milieu du ballon en plaçant un embout de pipette Pasteur sur le bord du ballon et en tenant le ballon presque horizontalement. Ajouter 4 ml de PMC Medium préchauffé par souris. Ajouter les facteurs de croissance IL-3 (10 ng/mL) et SCF (30 ng/mL). Placez le ballon contenant les cellules dans un incubateur (37 °C et 5 % de CO2).
- Jour 9 : Division des cellules
- Transférez la suspension cellulaire du ballon de culture cellulaire dans un tube à centrifuger en plastique de 50 ml. Lavez le ballon trois fois avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco's préchauffée (37 °C), en recueillant la suspension cellulaire avec les cellules détachées dans le même tube à centrifuger en plastique de 50 ml. Comptez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et calculez le nombre total de cellules.
- Centrifuger la suspension cellulaire à ~300 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Récupérer la pastille dans un milieu PMC préchauffé (37 °C) pour obtenir la concentration cellulaire 1 x 106 cellules/mL. Transférez la suspension cellulaire dans une nouvelle fiole deculture de 25 cm 2. Jetez l’ancienne fiole avec les fibroblastes adhérant au fond.
- Ajouter les facteurs de croissance IL-3 (10 ng/mL) et SCF (30 ng/mL) et placer le ballon contenant les cellules dans un incubateur (37 °C et 5 % de CO2).
- Jours 12 à 15 : Mesures cellulaires
- Si des expériences de stimulation des récepteurs FcɛRI sont prévues, prétraiter les cellules pendant la nuit avec 300 ng/mL d’IgE anti-DNP dans un milieu de culture standard.
2. Mesure de la libération de bêta-hexosaminidase dans les PMC
- Avant les mesures, préparez les matériaux énumérés dans le tableau 2.
REMARQUE : La β-hexosaminidase libérée par les MC après leur stimulation hydrolyse la p-nitrophényl-acétyl-D-glucosamine (pNAG) en p-nitrophénol et en N-acétyl-D-glucosamine. La quantité de β-hexosaminidase dans l’échantillon est proportionnelle à la quantité de p-nitrophénol qui se formera. Dans un environnement à pH élevé de « solution d’arrêt », le p-nitrophénol existe sous forme de p-nitrophénolat entièrement déprotoné et peut être détecté par son absorbance lumineuse à 405 nm.
- Préparez la solution de Tyrode contenant 130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,4 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM d'HEPES, 5,6 mM de glucose et 0,1 % de BSA. Ajustez le pH à 7,4 avec 3 M de NaOH.
- Préparez la solution de lyse en ajoutant un volume de 1 % de Triton X-100 à la solution de Tyrode.
- Préparez la solution stop composée de 200 mM de glycine et ajustez le pH à 10,7 avec du NaOH.
- Préparez la solution de pNAG (4-Nitrophényl 2-acétamido-2-désoxy-β-D-glucopyranoside) en dissolvant le pNAG dans de l’acide citrique 0,4 M jusqu’à une concentration finale de 4 mM.
- Calculer la quantité de cellules nécessaires au test (effectuer le test en double). Utilisez 200 000 SMP par puits. Utilisez 2 puits comme témoins négatifs (solution de Tyrode sans sécrétagogues tels que le DNP ou le composé 48/80) et 2 puits comme témoins positifs (solution de Tyrode avec 10 μM d'ionomycine) pour chaque génotype.
- Transférez les cellules dans un tube à centrifuger en plastique de 15 ml, ajustez le volume à 15 ml avec la solution de Tyrode et centrifugez à 200 x g pendant 4 min. Retirez le surnageant à l'aide d'une pipette Pasteur et remettez les cellules en suspension dans la solution de Tyrode à 2 x 106 cellules/mL.
- Transférez 100 μL de la suspension cellulaire par puits dans une plaque de puits à fond en V de 96 puits. Ajouter 25 μL de solution de stimulation ou de contrôle dans chaque puits (selon le schéma de pipetage illustré à la figure 1A). Incuber les cellules pendant 45 min à 37 °C et 5 % de CO2.
- Arrêtez la réaction en plaçant la plaque de 96 puits sur de la glace pendant 5 min. Ensuite, centrifugez la plaque à 4 °C pendant 4 min à 120 x g. Transvasez 120 μL du surnageant à l’aide d’une pipette multicanaux dans une plaque à fond plat de 96 puits et placez-le sur de la glace. Évitez soigneusement de toucher les pastilles de cellules, mais aspirez complètement le surnageant.
- Ajouter 125 μL de tampon de lyse aux pastilles de cellules. Incuber les pastilles cellulaires pendant 5 min à température ambiante et les remettre en suspension après l’incubation par pipetage répété (environ 5 fois).
- Pipette 25 μL de la solution pNAG (4 mM) dans les puits requis d’une nouvelle plaque à fond plat à 96 puits. Ajouter 25 μL de chaque surnageant à la solution préparée de pNAG ainsi que 25 μL de chaque lysat cellulaire.
- Incuber les lots de réaction pendant 1 h à 37 °C. Après l’incubation, pipeter 150 μL de solution d’arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction.
- Analysez la plaque à l’aide d’un lecteur de microplaques à l’aide d’un réglage à double longueur d’onde à 405 nm avec la référence 630 nm pour la soustraction automatique de l’arrière-plan. Dans le programme d’acquisition, cochez la case « Référence » et dans le menu des éléments du programme « Absorbance », sélectionnez « 630 nm » dans la liste déroulante. Si la densité optique des échantillons est trop élevée, préparez une dilution appropriée de la sonde avant de remesurer.
Tableau 1 : Matériaux pour l’étape 1.
| 1 | glace |
| deux | Seringues de 10 mL |
| 3 | Aiguilles de 27 g |
| 4 | Aiguilles de 20 g |
| 5 | Bloc et goupilles en polystyrène |
| 6 | Tubes de prélèvement (tubes à centrifuger en plastique de 50 ml) |
| 7 | 70 % d’éthanol |
| 8 | RPMI Medium (pré-réfrigéré et conservé sur glace) |
| 9 | PMC Medium : RPMI Medium + 20 % de FCS (sérum de veau fœtal) + 1 % de solution de pénicilline streptomycine (Pen-Strep) |
| 10 | Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco - DPBS (sans Ca2+ et Mg2+) |
| 11 | Flacons de culture (25 cm) |
| 12 | Solutions mères de facteurs de croissance (IL-3 : 1 μg/μL ; SCF : 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipettes sérologiques (10 mL) |
| 14 | Pointes de pipettes stériles (20–200 μL) |
| 15 | Hémocytomètre |
| 16 | Centrifugeuse de banc |
| 17 | Ciseaux et pinces |
| 18 | Chambre CO2 pour souris |
| 19 | Capot stérile ouvert |
| 20 | Capot stérile fermé |
| 21 | Incubateur cellulaire (37 °C et 5 % CO2) |
| 22 | Pipettes de transfert (20 à 200 μL) |
Tableau 2 : Matériaux pour l’étape 2.
| 1 | PMC (12 à 15 jours) 1 x 106 cellules/mL |
| deux | Solution mère d’anticorps anti-DNP (IgE) |
| 3 | Solution mère DNP-HSA |
| 4 | Solution mère composée 48/80 |
| 5 | L’ionomycine |
| 6 | Plaque à 96 puits, fond en V |
| 7 | Plaques à 96 puits, fond plat |
| 8 | Tubes à centrifuger en plastique (15 ml) |
| 9 | Pipettes sérologiques |
| 10 | Incubateur cellulaire (37 °C et 5 % CO2) |
| 11 | Centrifugeuse de banc |
| 12 | Lecteur de plaques de microtitration pour les mesures de densité optique |
| 13 | Pipette multicanaux (20 à 200 μL) |
| 14 | Hémocytomètre |
