Isolement et culture de cellules de Kupffer de souris

Résumé

Source : Bourgognon, M., et al. Isolement des cellules de Kupffer pour les essais de toxicité des nanoparticules. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement des cellules de Kupffer ou des macrophages hépatiques du foie de souris. Le foie est perfusé avec une solution de digestion suivie d’une séparation par gradient de densité. Les cellules de Kupffer adhérentes isolées peuvent être utilisées pour une analyse plus approfondie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Perfusion et collecte de cellules (Figure 1)

1. Préparez fraîchement tous les réactifs décrits dans le tableau des matériaux.
2. Réchauffez la solution EGTA (Ethylene Glycol Tetra-acetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) (50 ml par souris) et la solution de collagénase (100 ml par souris) pendant 30 min à 40 °C.
3. Rincez d’abord le tube flexible de la pompe avec de l’éthanol à 70 %. Versez 40 ml de la solution EGTA/HBSS dans un tube à centrifuger immergé dans le bain-marie et rincez le tube flexible de la pompe avec la solution EGTA/HBSS préchauffée.
4. Effectuez une anesthésie terminale à l’aide d’un barbiturique pour produire de manière fiable une perte de conscience avant la dépression respiratoire et la mort. Injecter du phénobarbital à raison de 1 mg/kg, i.p. chez une souris CD1 femelle ou mâle (35-45 g). Confirmez l’anesthésie par pincement des orteils.
5. Rasez les poils abdominaux et stérilisez la surface abdominale à l’aide d’une solution d’éthanol à 70 %.
6. Coupez à travers la cavité abdominale et exposez la veine porte et la veine cave inférieure en déplaçant l’intestin latéralement vers la gauche de l’abdomen.
7. Démarrer la pompe à une vitesse de 1 à 3 ml/min avec la solution EGTA/HBSS et canuler la veine porte à l’aide d’une aiguille papillon de 23 g (ailes coupées). Clampez la section de la veine porte canulée avec l’aiguille 23 G, puis retournez la pince serrefine à la surface de l’abdomen ouvert de la souris. Le foie devrait rapidement pâlir dans les 30 premières secondes suivant la perfusion de la solution EGTA/HBSS.
8. Inciser rapidement la partie inférieure de la veine cave inférieure pour éviter l’accumulation d’une pression excessive dans le foie, puis augmenter progressivement le débit jusqu’à 7 ml/min, au cours de la première minute de perfusion. L’animal meurt des suites d’une hémorragie secondaire à une ponction veineuse de la veine cave.
9. Lorsqu’il reste moins de 5 ml de la solution EGTA/HBSS dans le tube à centrifuger, remplissez-le avec la solution de collagénase (40-50 ml). Augmentez progressivement le débit jusqu’à 10 ml/min, sur 30 sec.
10. Faites gonfler le foie en appliquant une pression sur la veine cave inférieure, à l’aide d’une pince à épiler, pendant des intervalles de 5 à 10 secondes. Cela peut être fait périodiquement (5 à 10 fois pendant la digestion). Cette étape améliorera la dissociation des cellules hépatiques et réduira le temps de perfusion avec la collagénase.
11. Lorsqu’il reste moins de 10 ml de solution de collagénase dans le tube à centrifuger, verser 40 à 50 ml de solution de collagénase préchauffée dans le tube à centrifuger.
12. Après 10-15 min de perfusion et environ 70-80 ml de solution de collagénase perfusée, appliquez une petite pression sur la surface du foie avec une pince. Une impression de la pression indique que les cellules hépatiques sont dissociées.
13. Retirez le foie de la cavité abdominale en un seul morceau et placez-le dans un tube à centrifuger contenant 20 à 30 ml de milieu d’isolement des cellules de Kupffer. Conservez les cellules hépatiques sur de la glace ou à 4 °C pendant une période maximale de 3 heures pour éviter d’affecter la viabilité des cellules hépatiques.
14. Répétez la procédure de perfusion sur plusieurs animaux si nécessaire, tout en gardant le foie perfusé sur de la glace. Plongez un à trois foies pour la purification et passez à l’étape 3.

2. Préparation du gradient de densité pour la centrifugation (Figure 2)

1. Procéder aux étapes suivantes (sections 2, 3 et 5) dans des conditions stériles et maintenir les cellules sur de la glace ou à 4 °C. Préparez la solution SIP (solution de particules de silice enrobées isotoniques) en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice enrobée avec 1,7 ml de 10 x PBS.
2. Pour faire 20 ml de solution SIP à 25 %, mélangez 5 ml de SIP avec 15 ml de PBS. Pour préparer 20 ml de solution SIP à 50 %, mélangez 10 ml de SIP avec 10 ml de PBS.
3. Remplissez un tube de centrifugation avec 20 ml de la solution SIP à 50 %. Inclinez le tube de centrifugation à un angle proche de 90° et ajoutez lentement la solution SIP à 25 % (20 ml) sur la paroi latérale du tube à l’aide d’une pipette sérologique de 25 ml, sans toucher la surface de la couche SIP à 50 %. Lors de l’ajout de la solution SIP à 25 %, réduisez progressivement l’angle du tube. Maintenez le gradient de densité sur la glace jusqu’à l’utilisation.

3. Purification des cellules de Kupffer (Figure 3)

1. Mettez un foie perfusé dans une boîte de Pétri avec 15 ml de milieu d’isolement cellulaire Kupffer. Rompez la capsule de Glisson (membrane du foie) à l'aide de ciseaux et libérez toutes les cellules hépatiques dans le milieu d'isolement des cellules de Kupffer. Filtrez la solution à travers une crépine de 100 μm pour la recueillir dans un tube à centrifuger. Répétez la procédure de perfusion sur d’autres foies perfusés et regroupez les cellules dans le même tube de centrifugation (15 ml pour une souris et jusqu’à 45 ml pour trois souris).
2. Centrifuger la suspension cellulaire à 50 x g pendant 2 min à 4 °C. Les cellules parenchymateuses (hépatocytes) seront dans la pastille et les cellules non parenchymateuses (y compris les cellules de Kupffer) seront dans le surnageant.
3. Recueillir le surnageant dans un tube à centrifuger propre et centrifuger à 50 x g pendant 2 min chacun. Répétez cette étape trois fois de plus.
4. Centrifugeuse à 1 350 x g pendant 15 min pour granuler les cellules non parenchymateuses. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 ml de milieu d’isolement cellulaire Kupffer.
5. Ajouter la solution cellulaire non parenchymateuse sur le gradient isotonique discontinu 25/50 % comme décrit au point 2.3. Centrifugeuse à 850 x g pendant 15 min sans accélération ni pause.
6. Localiser la fraction de cellule de Kupffer enrichie apparaissant trouble dans la fraction SIP à 25 % proche de l’interface SIP 25/50 % (Figure 3). À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, aspirer environ 12 ml de la fraction de cellule de Kupffer enrichie. Transférez les cellules dans un tube à centrifuger contenant 35 à 40 ml de milieu d’isolement cellulaire Kupffer. Mélanger délicatement et centrifuger à 1 350 x g pendant 15 min à 4 °C sur des cellules de granulés.
7. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 5 à 10 ml de milieu de culture cellulaire Kupffer préchauffé. Compter les cellules (hémocytomètre) et mesurer la viabilité à l’aide de la coloration au bleu de trypan.
8. Plaquez les cellules non parenchymateuses purifiées dans des plaques à 24 puits à une densité de 5 x 10⁵ cellules/puits. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ (Figure 3). Après 30 min, retirez délicatement le milieu, lavez-le une fois avec une solution saline équilibrée Hank's (HBSS) préchauffée, puis remplacez-le par 500 μl de milieu de culture cellulaire Kupffer frais et préchauffé (par puits).

Résultats

Figure 1 : Perfusion hépatique. Après l’anesthésie de la souris, le tube digestif est déplacé latéralement vers la gauche de l’abdomen afin de rendre accessible la veine porte (PV). Le PV est canulé à l’aide d’un débit lent (1-3 ml/min) de solution EGTA/HBSS et la veine cave inférieure (IVC) est immédiatement rompue pour éviter tout excès de pression dans le foie. Dans la première minute de pe...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Euthatal (pentobarbital sodique)	Merial
Souris CD1	Rivière Charles	-	Le poids de la souris doit varier de 35 à 45 g. Nous conseillons l’utilisation de souris CD1 mâles car leur poids augmente rapidement (par exemple, une souris CD1 mâle de 7 semaines dépasse 35 g de poids). Il est également conseillé de contacter le fournisseur d’animaux à l’avance pour organiser la livraison des animaux plus âgés. Alternativement, les animaux peuvent être à l’intérieur de la maison pour atteindre le poids souhaité.
HBSS (sans Ca2+ et Mg2+, avec bicarbonate)	Technologies de la vie	Référence 14175-053	HBSS doit être exempt de Ca2+.
Sel tétrasodique d’acide tétraacétique d’éthylène glycol (EGTA)	Sigma-Aldrich	E8145	L’EDTA peut également être utilisé mais l’EGTA a l’avantage de chélater le Ca2+ de manière sélective.
HEPES (1M)	Technologies de la vie	Référence 15630-056	100 ml
Collagénase de type IV	Worthington	CSL-4	Il est conseillé de tester différents lots de collagénase ou au moins de mentionner au fournisseur que le produit doit être adapté à l’isolement des cellules hépatiques
DMEM à faible teneur en glucose	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (avec pyruvate de sodium et Glutamax®)	Technologies de la vie	Référence 12633-012	500 ml
Pénicilline/Steptomycine	Technologies de la vie	Référence 15140-122	100 ml
Sérum fœtal bovin	Premier lien	Référence 60-00-850	500 ml
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	Réf. T8154	100 ml
Solution de particules de silice enrobée (Percoll®)	GE Soins de santé	Référence 17-0891-02	Percoll® est très stable et peut être conservé plusieurs années
1x solution saline tamponnée au phosphate	Technologies de la vie	Référence 10010-023	500 ml
10x solution saline tamponnée au phosphate	Technologies de la vie	Référence 70011-036	500 ml
Kit de prélèvement de sang de papillon (tube de 23G/305mm de long)	Bd	367288
Filtres à seringue (0,22 μm Blue Rim)	Minisart	16534-K
Tubes à centrifuger (50 ml Blue Cap)	BD Biosciences, Faucon	35 2070
Boîte de Pétri (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
Crépine de cellules de 100 μm	Bd	Référence 352360
Pompe péristaltique	Watson Marlow	SciQ 300	Rincez la tubulure avant et après chaque utilisation avec du PBS stérile et de l’éthanol à 70 %.
Plaques à 24 puits	Corning	Référence 3526
centrifugeuse	Eppendorf	5810R
Pince Serrefine	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / N° cat. 221-0051	La pince serrefine permet de clamper le vaisseau canulé avec l’aiguille 23G sans avoir besoin de tenir la pince pendant la procédure de perfusion. Lien : (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Racleur de cellules	BD Biosciences, Faucon	353086	Coupez les extrémités des lames avec une paire de ciseaux pour gratter les cellules dans des plaques à 24 puits.
Solution EGTA (acide tétraacétique d'éthylène glycol)/HBSS (solution saline équilibrée de Hank)			HBSS contenant 0,5 mM d’EGTA et 25 mM d’HEPES. Ajustez le pH à 7,4. Préparez 50 ml pour chaque foie à perfuser.
Solution de collagénase			DMEM à faible teneur en glucose contenant de la collagénase de type IV à 100 UI/ml, 15 mM HEPES et 1 % de péniclline/streptamycine (v/v). Ajustez le pH à 7,4. Préparez 100 ml pour chaque foie à perfuser. Après avoir ajouté la collagénase, il est conseillé de réchauffer la solution pendant 30 min avant utilisation. Cela permet à l’activité de la collagénase d’être optimale.
Milieu d’isolement cellulaire de Kupffer			RPMI contenant 1 % d’acides aminés non essentiels (v/v), 1 % de glutamax® (v/v) et 1 % de péniclline/streptomycine (v/v). Préparez au moins 100 ml pour 1 à 3 foies.
Milieu de culture cellulaire Kupffer			RPMI contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % d’acides aminés non essentiels (v/v), 1 % de glutamax® (v/v) et 1 % de péniclline/streptamycine (v/v). Préparez au moins 100 ml pour 1 à 3 foies.
SIP (solution de particules de silice enrobées isotoniques)			Mélangez 1,7 ml de solution saline tamponnée 10x phosphate avec 15,3 ml de Percoll® pour obtenir 17 ml de SIP.
Solution SIP 25 %			Mélangez 5 ml de SIP avec 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate
Solution SIP à 50 %			Mélanger 10 ml de SIP avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate
Tampon de lyse			Média DMEM avec 0,9 % Triton X-100
Solution PBS/BSA			Préparez une solution saline tamponnée au phosphate fraîche pH 7,4 avec 1 % d’albumine sérique bovine.