Différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme en macrophages

Résumé

Source : Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production et caractérisation de macrophages humains à partir de cellules souches pluripotentes. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo décrit une méthode in vitro de génération de macrophages à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC). La génération de macrophages à partir d’iPSC se produit en trois étapes : (i) agrégation des iPSC en suspension pour former des corps embryoïdes (EB) tridimensionnels qui se différencient en cellules mésodermiques, (ii) formation de cellules précurseurs de macrophages à partir des EB différenciés, et (iii) différenciation des cellules précurseurs de macrophages en macrophages matures et fonctionnels.

Protocole

1. Différenciation des iPSC humaines en macrophages

REMARQUE : La figure 1 illustre un résumé schématique du protocole de différenciation des macrophages.

1. Préparation des facteurs de croissance de la différenciation cellulaire et d’autres réactifs
   1. Préparer des milieux sans sérum de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh-SFM ; voir le tableau des matériaux) en complétant l'Eagle medium-F12 modifié de Dulbecco (DMEM/F12) avec un supplément de hESC, 1,8 % p/v d'albumine sérique bovine (BSA) et 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol.
   2. Préparez une solution à 0,1 % p/v de gélatine porcine en dissolvant la gélatine dans de l’eau stérile. La solution de gélatine peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2 ans.
   3. Préparez une solution mère de protéine morphogénétique osseuse humaine (BMP4) (25 μg/mL) en dissolvant BMP4 dans une solution de chlorure d’hydrogène (HCl)-0,2 % de BSA PBS de 4 mM. Répartir la solution mère sous forme d’aliquotes de 50 μL dans des cryotubes. Les solutions mères peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 1 an. Une fois décongelé, le bouillon BMP4 peut être stocké à 4 °C pendant 5 jours.
   4. Préparez une solution mère de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain (VEGF) (100 μg/mL) en dissolvant le VEGF dans une solution BSA PBS à 0,2 %. Répartir la solution mère sous forme d’aliquotes de 10 μL dans des cryotubes. Les solutions mères peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 1 an. Une fois décongelé, le stock VEGF peut être conservé à 4 °C pendant 7 jours.
   5. Préparez une solution mère de facteur de cellules souches humaines (100 μg/mL) en dissolvant le SCF dans une solution de BSA PBS à 0,2 %. Répartir la solution mère sous forme d’aliquotes de 5 μL dans des cryotubes. Les solutions mères peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 1 an. Une fois décongelé, le stock SCF peut être conservé à 4 °C pendant 10 jours.
   6. Préparez une solution mère d’interleukine-3 humaine (IL3) (10 μg/mL) en dissolvant l’IL3 dans une solution BSA PBS à 0,2 %. Répartir la solution mère sous forme d’aliquotes de 500 μL dans des cryotubes. Les solutions mères peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 2 ans. Une fois décongelé, le stock IL3 peut être conservé à 4 °C pendant 15 jours.
   7. Préparez une solution mère de facteur de stimulation des colonies de macrophages humains (CSF1) (10 μg/mL) en dissolvant le CSF1 dans une solution de BSA PBS à 0,2 %. Répartir la solution mère sous forme d’aliquotes de 1 mL dans des cryotubes. Les solutions mères peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 2 ans. Une fois décongelé, le stock CSF1 peut être conservé à 4 °C pendant 15 jours.
2. Étape 1 : Génération des corps embryoïdes (jour 0 à jour 3)
   1. Le jour 0, ajouter 2,25 mL de milieu de l’étape 1 (hESC-SFM complété par 50 ng/mL de BMP4, 50 ng/mL de VEGF et 20 ng/mL de SCF) dans deux puits d’une plaque à 6 puits à très faible fixation.
   2. Remplacer le milieu d’entretien d’un puits confluent à 80 % de CSPi dans une plaque à 6 puits avec 1,5 mL de milieu de l’étape 1.
   3. Coupez les colonies à l’aide de l’outil de passage cellulaire et transférez les colonies coupées à l’aide d’une pipette dans les deux puits d’une plaque à 6 puits à fixation ultra-basse (voir le tableau des matériaux).
   4. Le jour 2, amener les cytokines à une concentration finale de 50 ng/mL de BMP4, 50 ng/mL de VEGF et 20 ng/mL de SCF en utilisant 0,5 mL de milieu hESC-SFM.
      note: Les colonies IPSC deviendront des EB (Figure 2A).
3. Etape 2 : Émergence de cellules hématopoïétiques en suspension
   1. Le jour 4, enduire 4 puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits avec de la gélatine à 0,1 % p/v et incuber pendant au moins 10 min.
   2. Retirer la gélatine et ajouter 2,5 mL de milieu de l’étape 2 (X-VIVO15 complété par 100 ng/mL de CSF1, 25 ng/mL d’IL-3, 2 mM de glutamax, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,055 mM de 2-mercaptoéthanol).
   3. Recueillir les EB formés dans un tube à centrifuger de 50 mL et les laisser se déposer au fond du tube par gravité. Aspirez soigneusement le support.
   4. Remettre les EB en suspension dans 2 mL de milieu de l’étape 2.
   5. Transvasez 10 à 15 EB (pas plus de 15) dans un puits recouvert de gélatine contenant 2,5 ml de milieu de l’étape 2.
   6. Incuber les EB à 37 °C et 5 % de CO₂ dans l’air.
   7. Changez de milieu sur les EB en plaque tous les 3 à 4 jours pendant 2 à 3 semaines.
   8. Après 2 à 3 semaines, les EB commencent à libérer des cellules hématopoïétiques non adhérentes en suspension.
      note: Cette période de libération des cellules en suspension peut varier et dépend de la lignée cellulaire. Les cellules de cette suspension peuvent être récoltées et transformées en macrophages (voir étape 3) (Figure 2A).
4. Étape 3 : Maturation terminale des macrophages
   1. Prélever les cellules hématopoïétiques en suspension et reconstituer le milieu (milieu de l’étape 2) sur la plaque EB.
   2. Cellules de suspension centrifugeuses à 200 x g pendant 3 min.
   3. Mettre en suspension les cellules en suspension dans un milieu de stade 3 (X-VIVO15 complété par 100 ng/mL de CSF1, 2 mM de glutamax et 1 % de pénicilline-streptomycine).
   4. Sur des plaques de 10 cm de qualité bactériologique (10 ml) ou sur des plaques de culture tissulaire à 6 puits non revêtues (3 mL) à une densité de^0,2 x 10 6 cellules/mL.
   5. Conservez les cellules dans les milieux de niveau 3 pendant 9 à 11 jours, en changeant de support tous les 5 jours.
      note: Les étapes 1.4.1 à 1.4.5 de l’étape 3 peuvent être répétées tous les 3 à 4 jours et les cellules en suspension peuvent être prélevées sur la plaque EB d’origine jusqu’à 3 mois.

Résultats

Figure 1 : Résumé graphique de la différenciation des iPSC en macrophages fonctionnels matures. Schéma dessiné avec Biorender.

Figure 2 : Différenciation des iPSC vers les macrophages et nombre et morphologie des iPSC-DM. (A

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CellMask Coloration à membrane plasmique rouge foncé	Thermopêcheur	Réf. C10046	Milieux de cryoconservation
Cryostor CS10	sigma	Réf. C2874
Substrat CTS CELLstart	Invitrogen	A1014201	Substrat de cellules souches
Gélatine pour peau de porc	sigma	Référence G9136
Protéine BMP4 humaine recombinante	R&D	Référence 314-BP-010
IL3 humaine recombinante	Préprotech	Référence 0200-03-10
MCSF humain recombinant (sans support) 100ug	Biolégende	574806
Protéine VEGF humaine recombinante	R&D	Référence 293-VE-010
SCF (C-Kit Ligand) Protéine humaine recombinante	Thermopêcheur	PHC2111
StemPro hESC SFM	Thermopêcheur	A1000701
Outil de passage de cellules souches jetable StemPro EZPassage	Thermopêcheur	23181010
Plaques de fixation ultra-faibles : Plaque multi-puits de culture cellulaire, 6 puits, surface répulsive des cellules en étoile cellulaire	Greiner	Référence 657970
2-Mercaptoéthanol (50 mM)	Invitrogen	31350010
DPBS, calcium, magnésium (500ml)	Thermopêcheur	14040091
Supplément GlutaMAX	Thermopêcheur	35050061