Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à San Francisco et ont été menées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Collecter des DRG lombaires sur des souris expérimentales
- Avant de commencer l’expérience, préparez la solution de travail du milieu à gradient de densité (par exemple, Percoll) en mélangeant 9 volumes du milieu avec 1 volume de HBSS 10x sans Ca++/Mg++. Gardez-le sur de la glace.
- Anesthésie la souris avec 2,5 % d’Avertin. Confirmer que l’animal est complètement anesthésié par l’absence de réponse au pincement de la patte arrière.
REMARQUE : Des souris mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées.
- Perfuser la souris par voie transcardiale avec 10 ml de PBS 1x pré-réfrigéré.
- Placez la souris en position couchée avec quatre pattes fixées avec le ruban adhésif à l’intérieur d’une hotte chimique. Soulevez la peau sous la cage thoracique à l’aide de la pince et faites une petite incision avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer le foie et le diaphragme.
- Continuez à utiliser des ciseaux pour couper le diaphragme et la cage thoracique, et ouvrez la cavité pleurale pour exposer le cœur qui bat.
- Coupez rapidement l’appendice auriculaire droit avec des ciseaux à iris. Une fois que le saignement est noté, insérez une aiguille de 30 G dans l’extrémité postérieure du ventricule gauche et injectez lentement 10 ml de PBS 1x pré-refroidi pour perfuser l’animal.
- Effectuer une laminectomie dorsale sur la souris placée en position couchée.
note: Si une culture cellulaire est prévue, vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 % avant l’incision et utilisez des instruments chirurgicaux pré-stérilisés pour la dissection.
- À l’aide d’un scalpel de taille 11, faites une incision latérale longitudinale profonde partant de la région thoracique jusqu’à la région sacrée. Retirez la peau avec les ciseaux pour exposer la couche musculaire dorsale.
- Utilisez le Rongeur de Friedman-Pearson pour décoller les tissus conjonctifs et les muscles jusqu’à ce que les processus de la colonne vertébrale lombo-sacrée et les processus transverses bilatéraux soient exposés.
- Utilisez une ciseau à ressort Noyes pour ouvrir soigneusement la colonne vertébrale dorsale, puis passez à un Rongeur Friedman-Pearson pour retirer les os vertébraux afin d’exposer la moelle épinière avec les nerfs spinaux intacts attachés.
- Disséquez soigneusement le DRG lombaire ipsilatéral et controlatéral (L4/L5 DRG dans notre étude) et placez-le dans 1 mL de HBSS 1x HBSS glacé et sans Ca++/Mg++ dans un homogénéisateur de tissus Dounce. Les mouchoirs sont maintenant prêts pour l’étape 2.
note: Coupez le nerf rachidien attaché au DRG si possible.
2. Isoler des cellules uniques du DRG lombaire de souris
- Homogénéisez le tissu DRG avec un pilon lâche dans l’homogénéisateur Dounce 20 à 25 fois.
- Placez une passoire stérile en nylon de 70 μm dans un tube conique stérile de 50 mL. Mouillez la crépine de la cellule avec 800 μL de 1x HBSS glacé, et le flux est collecté dans le tube conique.
- Prélever la suspension de tissu homogénéisé de l’homogénéisateur à l’aide d’une pipette et passer à travers la crépine humide à cellules de nylon de 70 μm dans le tube conique de 50 mL.
- Rincez l’homogénéisateur deux fois avec 800 μL de HBSS glacé, puis décantez-le dans le même tube conique de 50 ml avec une crépine à cellules pour augmenter le rendement.
- Ajouter 1,5 mL de milieu à gradient de densité isotonique glacé équilibré (préparé à l’étape 1.1) dans un tube stérile en polystyrène FACS de 5 mL.
- Transférez l’homogénat de cellule du tube conique de 50 mL (à l’étape 2.4) dans le tube FACS et mélangez bien avec le milieu à gradient de densité en pipetant de haut en bas. Ajoutez 500 μL supplémentaires de 1x HBSS pour sceller le dessus.
- Granuler les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 20 min à 4 °C.
- Aspirez soigneusement le surnageant contenant de la myéline dans le milieu sans perturber la pastille cellulaire au fond du tube FACS.
- Remettre les cellules en suspension dans un tampon PBS ou FACS contenant 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) pour l’analyse FACS.
note: Au moins 50 000 à 100 000 cellules sont attendues de la DRG L4/L5 d’une souris.
- Remettre en suspension les cellules DRG isolées mécaniquement (L4/L5) dans 100 μL de PBS contenant 5 % de sérum de veau fœtal, puis incuber avec l’anticorps CX3CR1-APC de souris α (1:2 000) dans l’obscurité à 4 °C pendant 1 h.
- Lavez une fois les cellules avec 5 ml de PBS et centrifugez les cellules à 360 x g pendant 8 min à 4 °C.
- Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension la pastille cellulaire dans 300 μL de PBS pour l’analyse FCAS. Si le tri des cellules est prévu, résuspendez les cellules dans la mémoire tampon FACS à la place.