Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Étapes d’excision chirurgicale et de préparation des tissus :
- Ablation chirurgicale de l’intestin grêle (IS)
- Euthanasier les souris par asphyxie au CO2 ou par toute méthode équivalente approuvée par le comité d’éthique animale de l’établissement.
- Transférez la souris dans une zone dédiée à l’excision chirurgicale. Placez le dos vers le bas et désinfectez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Effectuez une laparotomie en coupant la peau abdominale et le péritoine le long de la ligne médiane du pubis à la cage thoracique, ouvrant ainsi la cavité péritonéale.
note: Effectuez la première incision sur une zone relativement petite de la peau pour éviter de pénétrer dans la cavité péritonéale et d’endommager le tissu intestinal. Continuez l’exérèse jusqu’à la bordure anatomique souhaitée.
- Identifier le cæcum, qui est un repère idéal pour la détection de l’iléon terminal, qui constitue le segment distal de l’intestin grêle.
note: Le cæcum est généralement situé sur le côté inférieur gauche de l'abdomen de la souris.
- Localisez la jonction iléo-caïcale et faites une incision à ce niveau aussi distale que possible pour séparer l’intestin grêle du cæcum. Tout au long des étapes suivantes, évitez tout contact physique excessif avec la paroi intestinale car les PP fragiles s’effondrent facilement au toucher.
- Retirez délicatement tout l’intestin grêle jusqu’au sphincter pylorique en coupant le mésentère à l’aide de ciseaux. Identifiez la jonction entre le pylore et le duodénum, et coupez le duodénum à ce niveau, ce qui entraînera un détachement complet de l’intestin grêle de la cavité abdominale.
REMARQUE : (i) Évitez l’hyperextension car cela pourrait provoquer la rupture de la paroi intestinale. (ii) Si l’isolement des lymphocytes LP est souhaité en plus des lymphocytes PP, l’élimination complète de la graisse mésentérique est nécessaire. Cependant, pour l’isolement du PP uniquement, la graisse mésentérique restante pourrait apporter certains avantages lors des étapes d’isolement ultérieures ; Par conséquent, il doit être préservé.
- Placez l’intestin grêle détaché dans une plaque à 6 puits remplie de RPMI froid + sérum de veau fœtal à 10 % et agitez doucement les tissus manuellement jusqu’à ce que tous les segments intestinaux soient immergés dans le milieu froid. Maintenez les tissus sur la glace tout au long des étapes suivantes.
- Après avoir disséqué le nombre souhaité d’intestins grêles de souris, procédez à l’excision du PP à partir de l’intestin grêle collecté.
- Excision chirurgicale des PP et préparation de la suspension unicellulaire :
- Transférez doucement l’intestin grêle sur une serviette en papier en saisissant la graisse mésentérique à l’aide d’une pince et en plaçant le côté mésentérique face à l’essuie-tout. Humidifiez l’ensemble du segment intestinal avec du RPMI froid + 10 % FBS pour éviter la déshydratation et l’adhérence des tissus.
note: Le reste de la graisse mésentérique peut être utile à ce stade, car les segments de tissu adipeux du côté mésentérique de l’IS colleront à la serviette en papier en gardant le côté anti-mésentérique vers le haut.
- Identifiez les PP, qui apparaissent sous forme d’agrégats blancs multi-lobulés en forme de « chou-fleur » sur le côté anti-mésentérique de la paroi intestinale.
note: Il n’est pas recommandé de rincer le contenu luminal tant que tous les PP n’ont pas été excisés. Vider le contenu luminal peut provoquer l’effondrement des PP et empêchera le contraste de couleur entre les PP et la paroi intestinale, ce qui est très utile pour l’identification visuelle des PP.
- Après avoir identifié les PP du côté antitimesentérique, placez les ciseaux chirurgicaux à extrémité incurvée sur les PP (la courbe doit être tournée vers le haut) en retenant le PP de ses limites distales et proximales.
optionnel: Poussez doucement le PP vers les lames des ciseaux du bout du doigt. Cette manœuvre conduira à une meilleure exclusion des tissus non PP environnants. Excise doucement les PP, à l’exclusion des tissus intestinaux environnants.
REMARQUE : (i) Cette étape est cruciale pour obtenir un rendement maximal en cellules PP tout en minimisant la contamination cellulaire des compartiments intestinaux voisins tels que le LP et l’épithélium intestinal, qui sont également riches en cellules T. (ii) À partir d’un SI excisé d’une souris C57BL/6, 5 à 10 PP (taille moyenne, multi-lobulés) peuvent être collectés. En visant des PP encore plus petits (non multi-lobulés), il est possible de collecter jusqu’à 12-13 PP par souris (C57BL/6) à l’aide de ce protocole.
- Transférez les PP excisés dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits remplie de RPMI glacé + 10 % de FBS et maintenue sur de la glace à l’aide de pinces ou de ciseaux chirurgicaux incurvés.
REMARQUE : (i) Immédiatement après l’excision des PP, le mucus et le contenu intestinal sur la surface du PP peuvent être nettoyés en frottant doucement le tissu sur une serviette en papier. Cette étape contribuera à améliorer la viabilité des lymphocytes PP. (ii) Au lieu de transférer les PP sur une plaque, le transfert dans des tubes séparés peut également être envisagé en fonction du nombre total d’échantillons.
- Facultatif : Une fois l’excision du PP et le placement ultérieur dans la plaque de puits terminés, le nombre et la taille des PP collectés dans différents groupes expérimentaux/souris peuvent être documentés en prenant une photo de la plaque de culture tissulaire contenant des PP.
- Préparez un ensemble de tubes coniques de 50 mL remplis de 25 mL de RPMI + 10 % FBS (préchauffés à 37 °C). À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez le bord d’une pointe de 1 000 μL à la distance qui permettra l’aspiration des PP avec une pipette de 1 mL. Aspirez les PP à l’aide d’une pipette de 1 mL et transférez-les de la plaque de culture tissulaire à 12 puits dans les tubes coniques de 50 mL préparés.
note: Utilisez une nouvelle astuce pour chaque échantillon de souris afin d’éviter la contamination croisée entre les échantillons.
- Fixez le couvercle et placez les tubes verticalement dans un agitateur orbital à 37 °C, avec une agitation continue à 125-150 tr/min pendant 10 min. Pendant ce temps, préparez un nouvel ensemble de tubes de 50 ml et placez une crépine à cellules de 40 μm sur le dessus de chaque tube, à travers laquelle une suspension à cellule unique sera préparée.
REMARQUE : (i) L’étape d’agitation éliminera le contenu intestinal restant, le mucus et les débris cellulaires, qui diminuent la viabilité cellulaire et la récupération des lymphocytes PP s’ils ne sont pas éliminés. (ii) N’appliquez aucun type d’enzymes digestives sur le tissu PP car le processus de digestion provoque une perte spectaculaire de l’expression de CXCR5 à la surface de la cellule.
- Après l’agitation, transférez les PP dans la passoire à cellules de 40 μm placée sur le dessus des tubes coniques de 50 mL nouvellement préparés. À l’aide du côté arrondi d’un piston de seringue de 10 ml, perturber doucement les PP à travers la crépine cellulaire pour générer une suspension unicellulaire. Rincer la passoire avec 15 à 20 ml de RPMI froid + 10 % FBS.
REMARQUE : (i) Avant de filtrer, secouez les tubes contenant les PP horizontalement. Cette courte secousse facilitera le transfert des PP dans les crépines cellulaires. (ii) Il est recommandé d’utiliser une crépine cellulaire de 70 μm pour l’isolement des cellules immunitaires non lymphoïdes (p. ex., monocytes, macrophages, CD).
- Centrifuger les suspensions unicellulaires à 350–400 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Jeter soigneusement le surnageant et remettre les cellules en suspension à une concentration de 10 x 106 cellules/mL. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.