Isolement de cellules mononucléées du sang périphérique à partir de couches leucocytaires humaines

Résumé

Source : Mily, A., et al. Polarisation de cellules humaines dérivées de monocytes M1 et M2 et analyse par cytométrie en flux sur l’infection à Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement de cellules mononucléées du sang périphérique, PBMC, contenant des monocytes et des lymphocytes à partir d’une couche leucocytaire humaine par centrifugation par gradient de densité. Les PBMC isolés peuvent être utilisés pour une analyse plus approfondie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Préparation des milieux

REMARQUE : Les détails sur tous les réactifs et consommables sont fournis dans la Table des matériaux.

1. Milieu complet RPMI : Supplément RPMI 1640 avec 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 10 mM d’HEPES et 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur. Évitez les antibiotiques dans le milieu de culture cellulaire lorsque vous travaillez avec une infection à Mtb.
2. Milieu RPMI sans sérum : Supplément RPMI 1640 avec 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine et 10 mM d’HEPES.

2. Isolement de cellules mononucléées du sang périphérique à partir de couches leucocytaires

REMARQUE : Effectuez tous les travaux avec du sang humain (potentiellement contagieux) à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité de classe II. Inactiver les produits sanguins résiduels avec des désinfectants pendant 15 minutes avant de les jeter. Dans ce cas, le sang a été prélevé sur des volontaires sains. Ce protocole de différenciation des macrophages in vitro a été mis en place pour inclure 10 x 10⁶ PBMC isolés/donneur/puits. De chaque donneur, une couche leucocytaire contient environ 50 ml d’une suspension leucocytaire concentrée provenant du sang total, qui fournit normalement 500 à 800 x 10⁶ PBMC à partir desquels environ 10 % ou 50 à 80 x 10⁶ monocytes peuvent être prélevés.

1. Chargez 15 mL de sang leucocytaire sur 15 mL de milieu à gradient de densité préparé dans un tube de 50 mL. Superposez lentement du sang sur la couche de gradient de densité en inclinant la pointe de la pipette contre la paroi du tube.
2. Faites tourner les tubes à 600 x g pendant 25 min à température ambiante (RT) avec 0 accélération et 0 décélération.
   note: Fermez soigneusement les couvercles avant la centrifugation et vérifiez toujours que les supports de tube ne débordent pas après la centrifugation.
3. Retirez la couche supérieure de plasma à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, puis prélevez soigneusement la couche de cellules mononucléées dans un nouveau tube de 50 ml à l’aide d’une pipette Pasteur stérile. Ajouter un milieu RPMI sans sérum à la pastille PBMC pour obtenir un volume final de 50 mL. Mélangez soigneusement en retournant le tube plusieurs fois avant la centrifugation à 500 x g pendant 5 min à RT.
4. Jetez le surnageant avec précaution et remettez la pastille en suspension en retournant le bas du tube à l’intérieur des doigts.
5. Pour éliminer la contamination des PBMC par le milieu à gradient de densité, laver les cellules 2 à 3 fois avec du RPMI sans sérum pour obtenir un volume final de 50 ml. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à RT. Laver jusqu’à ce que le surnageant cellulaire devienne transparent.
6. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 20 mL de milieu RPMI sans sérum.
7. Comptez les cellules par coloration au bleu de trypan, manuellement à l’aide d’un hémocytomètre ou à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Diluer la suspension cellulaire dans du bleu de trypan en dilution 1:2 ou 1:10 en mélangeant l’échantillon de bleu de trypan cellulaire dans une plaque à 96 puits, par exemple 50 μL + 50 μL (pour le comptage par hémocytomètre) ou 10 μL + 10 μL (pour le comptage automatisé des cellules) et compter les cellules pour obtenir le nombre de cellules vivantes/mL.
   prudence: Le bleu de trypan est toxique et doit être jeté dans un déchet chimique séparé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lymphoprep	Alere Technologies AS	11508545
RPMI 1640	Société des technologies de la vie	SH30096.01
EDTA (0,5 M)	Hôpital universitaire Karolinska, Huddinge	n/a
Na-pyruvate	GE Healthcare Sciences de la vie	SH300239.01
L-Glutamine	GE Healthcare Sciences de la vie	SH30034.01
HEPES	GE Healthcare Sciences de la vie	SH30237.01
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524