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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Différenciation et polarisation des cellules dérivées de monocytes
- Utilisez de l’adhérence plastique pour isoler les monocytes. Brièvement, ensemencer des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) fraîchement isolées dans une plaque de culture à 6 puits à une concentration appropriée, par exemple, 10 x 106 PBMC/puits dans un milieu RPMI sans sérum de 2 mL (supplément RPMI 1640 avec 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine et 10 mM d’HEPES) et incuber à 37 °C et 5 % de CO2.
- Après 2 à 3 h, retirez les cellules non adhérentes à l’aide d’une pipette et lavez les puits 3 fois avec 1 ml de milieu sans sérum. Les cellules attachées sont des monocytes et représentent environ 10 % du total des PBMC ajoutés au puits, c’est-à-dire 106 monocytes prélevés sur 10 x 106 PBMC ajoutés par puits.
- Pour la différenciation des macrophages, préparer une solution de travail contenant 50 ng/mL DE GM-CSF ou de M-CSF pour la polarisation des macrophages M1 et M2 respectivement, ajoutée dans 2 mL de milieu complet RPMI par puits. Cultivez les cellules dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 3 jours.
- Le jour 3, prélever soigneusement 1 mL de milieu de culture cellulaire de la couche supérieure de chaque puits et compléter les cultures cellulaires avec 1 mL de milieu complet RPMI frais contenant la double concentration de M-CSF ou de GM-CSF pour obtenir une concentration finale de 50 ng/mL dans les puits. Ajoutez les facteurs de croissance dans une solution de travail préfabriquée de 100 ng/mL/puits.
- Le jour 6, ajouter différents stimuli pendant les 18 à 20 dernières heures de différenciation cellulaire pour obtenir M1 complètement polarisé et mature (interféron-γ ; IFN-γ et lipopolysaccharide ; LPS (E. coli O55 :B5)) ou M2 (interleukine 4 ; IL-4). Pour la polarisation M1, préparer l’IFN-γ et le LPS dans un milieu complet RPMI (supplément RPMI 1640 avec 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 10 mM d’HEPES et 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur)) et ajouter 50 μL par puits pour obtenir une concentration finale de 50 ng/mL d’IFN-γ et de 10 ng/mL de LPS dans les cultures cellulaires. Pour la polarisation M2, préparer l’IL-4 dans un milieu complet RPMI et ajouter 50 μL par puits pour obtenir une concentration finale de 20 ng/mL dans les cultures cellulaires.
- Pour la différenciation des macrophages polarisés M0, stimulez les cellules avec du M-CSF uniquement, sans cytokines supplémentaires (fournissant un phénotype de type M2).
- Vérifiez régulièrement la morphologie des cultures cellulaires dérivées de monocytes à l’aide de la microscopie optique pour vous assurer que les monocytes plus petits sont différenciés en cellules plus grandes ressemblant à des macrophages. Surveillez également les différences morphologiques potentielles entre les polarisations M1 et M2, c’est-à-dire les cellules M1 allongées et étirées par rapport aux cellules M2 de forme plus arrondie.