Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des cellules d’alimentation AC-6
Remarque : La lignée cellulaire stromale AC-6.21 (AC-6 en abrégé) (fournie par I. Weissman, Université de Stanford) doit être maintenue dans RPMI complétée par 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS). Pour servir de cellules nourricières, les cellules AC-6 sont irradiées γ avec 3 000 rad (30Gy) un jour avant la co-culture afin d’éviter leur prolifération. Notez que les cellules AC-6 ont tendance à perdre leur capacité de soutien à la différenciation si elles sont laissées surpeuplées pendant la maintenance, ou si leur nombre de passages est supérieur à 20.
- Lavez une fois les cellules AC-6 avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et éliminez le DPBS par aspiration. Traitez les cellules AC-6 avec 0,8 ml de solution de trypsine (0,05 % de trypsine et 0,5 mM d’EDTA dans le DPBS) pendant 3 à 5 minutes à 37°C, 5 % de CO2, puis arrêtez la réaction en la diluant avec 10 volumes de milieu de culture pour obtenir une suspension unicellulaire.
- Ensemencer des cellules AC-6 à 5,9 x 104 cellules/puits dans des plaques à 12 puits et les incuber à 37°C, 5 % de CO2 O/N.
note: La densité des cellules AC-6 est très importante car une densité plus faible favorisera la génération de cDC. L’ensemencement à une densité de 5,9 x 104 cellules/puits permettra à AC-6 d’atteindre la confluence le lendemain, ce qui est optimal pour le calcul des pDC à partir des CLP.
- Irradiez des cellules AC-6 à 3 000 rad (30 Gy) à l’aide de γ-irradiator.
Remarque : La dose utilisée pour irradier l’AC-6 est optimisée pour empêcher les cellules de proliférer tout en les maintenant viables suffisamment longtemps pour fournir les cytokines et le contact cellule-cellule nécessaires à la différenciation des DC des CLP.
- Aspirer le milieu et le remplacer par 1 ml de RPMI complet (RPMI avec 10 % de FBS inactivé à la chaleur, 50 μg/ml de gentamycine et 50 μM de β-mercaptoéthanol).
2. Isoler les cellules BM de souris
- Sacrifiez les souris par asphyxie au CO2 et luxation cervicale. Placez les souris sur un plateau de dissection et stérilisez-les avec de l’éthanol à 70 %. Faites une incision au milieu de l’abdomen et retirez la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau recouvrant les membres inférieurs.
- Disséquez les souris dans une cagoule semi-stérile. Pour libérer le fémur et le tibia, coupez le fémur au-dessus et le tibia en dessous de l’articulation du genou. Détachez les muscles des os à l’aide de ciseaux et placez les os dans une boîte de Pétri de 6 cm contenant 5 ml de RPMI complet.
- Passez à une hotte de culture stérile. Remplissez une seringue de 3 ml reliée à une aiguille 27G avec RPMI complet. Coupez les deux extrémités des os à l’aide de ciseaux et insérez l’aiguille 27G pour rincer la moelle des os en injectant doucement un RPMI complet une fois à chaque extrémité.
- Préparez une suspension unicellulaire en pipetant doucement les cellules de haut en bas 3 à 5 fois dans la boîte de culture à l’aide de la seringue sans l’aiguille.
- Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g et décanter le surnageant.
- Lyser les globules rouges avec 1 ml de tampon ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) en incubant pendant 1 min et en arrêtant la réaction en diluant avec 10 volumes de RPMI complet. Laissez les cellules reposer pendant 5 minutes afin d’éliminer les amas de cellules mortes et les débris de tissus par gravité.
note: Ne restez pas debout plus de 5 minutes car cela entraînerait une perte de cellules due à la fixation de cellules viables.
- Décanter lentement le surnageant contenant la cellule dans un nouveau tube, laissant des débris dans le tube d’origine.
- Centrifugez pendant 5 min à 500 x g pour granuler les cellules, puis retirez et jetez le surnageant.
- Rémettez en suspension les cellules BM totales (généralement 4-6 x 10 7 cellules BM sont obtenues à partir d’une souris) dans un tampon FACS de 100 μl (1x PBS+ 2 % FBS+ 1mM EDTA).
3. Analyse FACS et tri des CLP
- Ajouter l’anti-CD16/32 (clone d’hybridome surnant 2.4G2, 50 μl/réaction ou 1-2 μg/réaction) dans les cellules du tampon FACS (étape 2.9) pendant 1 à 2 min afin de bloquer les récepteurs Fc.
note: L’anti-CD16/32 est également appelé bloc Fc, qui est ajouté pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps aux cellules exprimant les récepteurs Fc, y compris les granulocytes, les monocytes et les lymphocytes B.
- Colorez simultanément les cellules avec les anticorps marqués par un colorant fluorescent suivants (pour 4x107 cellules) pendant 15 min sur de la glace, en évitant la lumière ambiante. Anticorps : marqueurs de lignée conjugués au PE (0,2 μg chacun) y compris l’anti-CD3 (17A2), l’anti-CD8 (53-6,7), l’anti-B220 (RA3-6B2), l’anti-CD19 (eBio1D3), l’anti-CD11b (M1/70), l’anti-Gr-1 (RB6-8C5), l’anti-Thy1.1 (HIS51), l’anti-NK1.1 (PK136), l’anti-TER119 (TER-119) et l’anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 μg anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 μg anti-M-CSFR-APC (AFS98) et 0,2 μg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Laver les cellules avec un tampon FACS de 3 ml et centrifuger pendant 5 min à 500 x g.
- Remettez les cellules en suspension dans un tampon FACS de 300 μl et filtrez les cellules à travers une crépine de cellules de 40 μM.
- Lavez le tube avec un tampon FACS supplémentaire de 100 μl pour récupérer les cellules restantes et filtrez-le dans un tube de tri FACS stérile à l’aide de la même passoire de cellules.
- Effectuer une analyse cytométrique en flux immédiatement après la coloration à l’aide de filtres et de tensions appropriés pour la détection du signal. Utilisez un laser de 488 nm pour détecter les anticorps marqués FITC et PerCP-Cy5.5, un laser de 561 nm pour détecter les anticorps marqués PE et PE-Cy7, et un laser de 633 nm pour détecter l’anticorps marqué APC.
- Triez les CLP selon les marqueurs suivants : lin-c-kit,int, Sca-1,int, M-CSFR-IL-7Rα+ (comme coloré à l’étape 3.2) à l’aide d’un trieur de cellules. Recueillir les cellules triées dans un tube de 15 ml contenant 8 ml d’IPRP complet en coussin.
- Enregistrez le nombre absolu de cellules triées tel qu’indiqué par le trieur de cellules à la fin de l’exécution. En règle générale, 5x104 CLP peuvent être obtenus à partir du BM d’une souris.
4. Coculture CLPs et AC-6
- Centrifugez les cellules triées à partir de l’étape 3.7 pendant 10 minutes à 500 x g, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec suffisamment de RPMI complet pour obtenir une densité cellulaire d’environ 5 x 104 cellules/ml. Ensemencez 500 cellules/puits dans la plaque à 12 puits contenant les cellules nourricières préparée à l’étape 1.4.
- Ajouter 100 ng/ml de FL (hu-Flt3L-Ig généré en interne à l’aide d’un système d’expression fourni par M. Manz, Hôpital universitaire de Zurich, Suisse) et incuber à 37°C, 5 % de CO2 avec surveillance visuelle périodique du développement des DC au microscope.
note: Le FL humain recombinant ou le FL de souris disponibles dans le commerce peuvent être utilisés comme substitut de hu-Flt3L-Ig pour soutenir le développement de DC.
- Recueillir les cellules dans le surnageant le jour 12 et laver les puits une fois avec 0,5 ml de milieu RPMI complet combinant les surnageants obtenus. Ajoutez 0,5 ml de milieu frais et grattez les cellules adhérentes à l’aide d’un grattoir à cellules.
- Mélanger le milieu contenant les cellules des deux parties et centrifuger pendant 5 min à 500 x g.
- Décantez les cellules surnageantes et mettez-les en suspension dans un tampon FACS de 50 μl. Ajouter 50 μl de surnageant d’hybridome anti-CD16/32 et incuber pendant 1 à 2 minutes pour bloquer les récepteurs Fc.
- Dénombrer et colorer toutes les cellules avec les anticorps suivants (0,05 μg chacun) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC et anti-B220-PE.
- Lavez et centrifugez les cellules comme décrit à l’étape 3.3.
- Remettez les cellules en suspension dans une mémoire tampon FACS de 100 μl, faites une porte sur CD11c+ et analysez les cDC (CD11c+CD11b+B220-) et les pDC (CD11c+CD11b-B220+).