Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)
- Préparation du réactif
- Préparez PBS/EDTA : solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et complétez avec 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Stérilisez cette solution par filtration à travers un filtre de 0,2 μm. REMARQUE de conserver le PBS/EDTA à 4 °C et de le réchauffer à température ambiante avant utilisation.
- Préparez le tampon de coloration : supplément de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 2 % de sérum de veau fœtal (FBS), 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanesulfonique (HEPES) et 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Stérilisez cette solution par filtration à travers un filtre de 0,2 μm.
- Prélever du sang dans le Cône de sang
note: Le cône sanguin contient des composants de globules blancs prélevés après une plaquettaire à l’hôpital. Si le sang est prélevé dans des tubes d’héparine ou d’EDTA, diluez le sang avec du PBS dans un rapport de 1:1 et passez à l’étape 1.3 ; si une couche leucocytaire est reçue, diluez la couche leucocytaire avec du PBS dans un rapport de 1:2 et passez à l’étape 1.3.
- Coupez les deux extrémités du cône pour permettre au sang de s’écouler dans un tube de 50 ml.
Notez que le cône contient généralement 10 ml de sang.
- À l’aide d’une seringue à bout émoussé contenant 30 ml de PBS/EDTA, laver le cône et le recueillir dans un tube de 50 ml.
- Diluez davantage le sang avec du PBS/EDTA jusqu’à un volume final de 80 ml.
- Isolement des PBMC par centrifugation par densité
- Aliquote de 15 ml de Ficoll chacun en 4 tubes frais de 50 ml.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 25 ml, ajoutez 20 ml de sang dilué sur la couche de Ficoll. Prenez note de tenir le tube de 50 ml à un angle de 45 et veillez à ne pas perturber l’interphase.
- Centrifuger les tubes à 805 x g sans freins pendant 30 min, 20 °C.
- Retirez la couche de plasma et prélevez l’anneau de PBMC situé juste en dessous de la couche de plasma à l’aide d’une pipette Pasteur. Combinez quatre tubes de PBMC dans deux tubes de 50 ml. Attention : évitez de collecter la couche transparente sous les PBMC.
- Ajouter du PBS/EDTA à un volume final de 50 ml par tube de PBMC et centrifuger à 548 x g avec freins pendant 10 min, 20 °C.
- Aspirez le surnageant et remettez en suspension les pastilles dans chaque tube avec 25 ml de tampon de coloration et combinez-les dans un tube de 50 ml.
- Centrifugeuse à 367 x g avec freins pendant 5 min, 4 °C.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 10 ml de tampon de coloration.
2. Enrichissement des monocytes par séparation magnétique
- Déterminer le numéro de cellule
- Prenez 20 μl de suspension de cellules PBMC et mélangez-les avec 20 μl de bleu de trypan pour compter le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un cytomètre.
- Suspension de la cellule de centrifugation à 367 x g avec freins pendant 10 min, 4 °C.
- Aspirer complètement le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire à une concentration de 10à 7 cellules par 80 μl de tampon de coloration.
- Étiquetage magnétique
- Ajouter 20 μl de microbilles CD14 par 107 cellules, bien mélanger et incuber pendant 15 min à 2 - 8 °C.
- Laver les cellules en ajoutant 1 ml de tampon de coloration pour 107 cellules et centrifuger à 367 x g avec freins pendant 10 min, 4 °C.
- Aspirer complètement le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire à une concentration de 10à 7 cellules par 50 μl de tampon de coloration.
- Séparation magnétique
- Utilisez une colonne de taille moyenne pour un maximum de 2 x 108 cellules au total.
note: Choisissez une colonne et un séparateur appropriés en fonction du nombre total de cellules et du nombre de cellules CD14+ recommandés dans la fiche technique.
- Placez la colonne dans le champ magnétique d’un séparateur approprié et préparez la colonne en la rinçant avec 500 μl de tampon de coloration.
- Pipetez la suspension cellulaire sur la colonne et collectez les cellules non marquées qui passent à travers la colonne avec un tube de 15 ml.
- Replacez un nouveau tube de 15 ml sous la colonne et lavez la colonne 3 fois avec 500 μl de tampon de coloration. Assurez-vous que le réservoir de la colonne est vide avant d’ajouter un nouveau tampon de coloration entre les lavages.
- Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube frais de 15 ml.
- Pipeter 1 ml de tampon de coloration sur la colonne. Rincez immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston (fourni dans le kit) dans la colonne.
- Répétez les étapes 2.3.2 à 2.3.6 en utilisant la fraction éluée sur une nouvelle colonne pour augmenter la pureté des cellules CD14+. Notez que les billes seront libérées automatiquement des cellules en culture lors de l’étape 3.2.
3. Différenciation des cellules dendritiques en différents états d’activation
- Préparation du réactif (le niveau d’endotoxine doit être inférieur à 0,1 UE/ml dans tous les réactifs)
- Préparez le milieu de culture cellulaire : RPMI 1640 complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS), 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA) et 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol (2ME). Stérilisez cette solution par filtration à travers un filtre de 0,2 μm.
- Préparer les cytokines : reconstituer l’IL-4 et le GM-CSF dans de l’eau de culture cellulaire à une concentration de 0,25 mg/ml respectivement dans des conditions aseptiques. Aliquote des cytokines dans des tubes de microcentrifugation de 200 μl et stockez-les à -80 °C.
- Préparer le stock de vitamine D3 : reconstituer la vitamine D3 dans de l’eau de culture cellulaire jusqu’à une concentration de 100 mM dans des conditions aseptiques. Aliquote de la vitamine D3 dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et conservez-la à -20 °C.
- Préparer le stock de dexaméthasone : reconstituer la dexaméthasone dans de l’eau de culture cellulaire à une concentration de 10 mM dans des conditions aseptiques. Aliquote de dexaméthasone dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et conservez-la à -20 °C.
- Préparer le LPS : reconstituer les lipopolysaccharides (LPS) dans de l’eau de culture cellulaire à une concentration de 1 mg/ml dans des conditions aseptiques. Aliquote LPS dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et conserver à -20 °C.
- Génération de différents moDC
- Semez 4 séries de monocytes CD14+ à une concentration de 0,3 - 0,5 x 106/ml de milieu de culture cellulaire complété par 200 ng/ml de GM-CSF et 200 ng/ml d’IL-4 dans des plaques à 6 puits. Notez qu’il s’agit du jour 0 et que le volume de milieu dans chaque 6 puits est de 2 ml.
- Incuber des cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Retirer 850 μl de milieu de culture au jour 4 et centrifuger à 300 x g pendant 5 min, 4 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 ml de milieu de culture cellulaire contenant 2 fois (200 ng/ml de GM-CSF et 200 ng/ml d’IL-4). Ajoutez ce mélange cellulaire à la culture. Notez que la concentration de 2x ajoutée pour le GM-CSF et l’IL-4 deviendra 1x lorsque 1 ml de milieu sera rajouté dans la culture.
- Ajouter 1 μl de vitamine D3 et 1 1 l de dexaméthasone par ml de milieu à deux des séries le jour 5 pour générer des moDC tolérogènes. Notez que la concentration finale de vitamine D3 est de 100 nM et la dexaméthasone est de 10 nM ; l’ajout de GM-CSF et d’IL-4 n’est pas requis le jour 5.
- Ajouter 200 ng/ml de GM-CSF et 200 ng/ml d’IL-4 à toutes les séries le jour 6.
- Ajouter 1 μg/ml de LPS à l’un des ensembles traités uniquement avec du GM-CSF et de l’IL-4 au jour 6 pour générer des moDC matures.
- Ajoutez 1 μg/ml de LPS à un ensemble de moDC tolérogènes le jour 6 pour générer des moDC tolérogènes au LPS.
- Récoltez les différents types de moDC le jour 7 en rinçant la boîte de culture avec du PBS, de l’EDTA pour la cytométrie en flux ou d’autres études. Notez que seules les cellules non adhérentes sont récoltées. Notez que le rendement en pourcentage des monocytes CD14+ pour les moDC immatures, les moDC matures, les moDC tolérogènes et les DC tolérogènes au LPS est d’environ 90 %, 50 %, 60 % et 60 % respectivement, et varie entre les donneurs de sang et le lot FBS.
