Isolement et purification des lymphocytes B du sang périphérique humain

Résumé

Source : Tzeng, S. J. L’isolement, la différenciation et la quantification des lymphocytes B sécrétant des anticorps humains à partir du sang : ELISpot en tant que lecture fonctionnelle de l’immunité humorale. J. Vis. Exp. (2016)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement des lymphocytes B du sang périphérique humain à l’aide d’anticorps biotinylés spécifiques des lymphocytes non B et de microbilles magnétiques conjuguées à la streptavidine.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local

1. Isolement et purification des lymphocytes B du sang périphérique humain

1. Prélever ~ 10 ml de sang de la veine cubitale médiane (dans la fosse cubitale antérieure au coude) dans un tube de 15 ml contenant du K₂EDTA (1,5 à 2,0 mg/ml de sang) et retourner immédiatement le tube plusieurs fois pour prévenir la formation de caillots.
2. Ajouter 35 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR) autoclavé (121 °C, 15 min) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ et 1 mM EDTA ; pH 7,4) dans le tube contenant l’échantillon de sang frais (≥ 3:1 vol/vol) et incuber à température ambiante (RT) pendant au plus 5 min
   note: L’apparition d’une transmission de la lumière à travers le tube indique la fin de la lyse des globules rouges.
3. Centrifuger à 600 x g à RT pendant 5 min. Assurez-vous que la pastille est de couleur blanche.
4. Remettre la pastille en suspension avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate autoclavée (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄ et 1,47 mM KH₂PO₄ ; pH 7,4) et centrifuger comme à l’étape 1.3.
5. Jeter le surnageant, remettre la pastille en suspension avec 10 mL de milieu RPMI 1640 (suppléments : 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine), puis déposer les cellules dans une boîte de culture de 10 cm (10 mL de sang par boîte). Placez le plat dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 30 min.
6. Agitez doucement la boîte de culture à quelques reprises et placez le milieu de culture (cellules de suspension) dans des tubes coniques en plastique de 15 ml. Jetez les cellules adhérentes (principalement des macrophages) sur les boîtes de culture.
7. Centrifuger à 600 x g à RT pendant 5 min. Jeter le surnageant.
8. Remettre la pastille en suspension avec 1 mL de milieu RPMI 1640. Comptez le numéro de cellule à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
   note: La viabilité des leucocytes isolés est normalement supérieure à 90 % à l’exclusion du bleu de trypan.
9. Centrifuger comme à l’étape 1.7 et remettre les cellules en suspension dans ~ 200 μL de tampon PBS froid (0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’EDTA) à la concentration de 5 - 10 x 10⁶ cellules/mL.
10. Ajouter 5 μL de cocktail Ab biotinylé anti-humain spécifique aux cellules sanguines (pour la sélection négative des lymphocytes B) par 10^{à 6} cellules et incuber sur glace pendant 30 min.
    note: Le cocktail d’anticorps anti-humains doit au moins inclure des Abdominaux spécifiques aux CD2 (ou CD3), CD14 et CD16.
11. Ajouter un volume excédentaire de 10 fois plus de PBS stérile dans les cellules, centrifuger à 600 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
12. Ajoutez des quantités égales de microbilles conjuguées à la streptavidine (5 μL par 10^{à 6} cellules) à la pastille et mélangez soigneusement.
13. Incuber sur glace pendant 30 min dans un tube conique en plastique de 15 ml.
14. Ajoutez 2 ml de tampon PBS dans le tube.
15. Placez le tube dans un support magnétique et incubez à RT pendant 8 min. Les microbilles brunes se fixeront progressivement à la paroi du tube à côté de l’aimant.
16. Avec le tube restant dans le support magnétique, transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube stérile de 15 ml.
17. Répétez les étapes 1.14 à 1.16 et combinez les deux surnageants qui contiennent les lymphocytes B intacts. Jetez les microbilles.
18. Centrifuger à 600 x g à RT pendant 5 min. Jeter le surnageant.
19. Remettre la pastille en suspension dans un milieu RPMI 1640 pour les expériences en aval.
    note: En règle générale, 1 à 5 x 10^{cellules B 5} d’une pureté supérieure à 95 % à partir de 10 ml de sang périphérique peuvent être isolés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	Tube de 10 ml
Ficoll-Paque Plus	GE Soins de santé	Référence 17-1440-02	Sans endotoxines
Bleu d’essaipan à 0,5 % solution	Industries biologiques	Référence 03-102-1B	teindre
IMag Kit d’enrichissement des lymphocytes B humains	BD Biosciences	558007	Réactif
Microbilles magnétiques de streptavidine	BD Biosciences	9000810	Réactif
Tubes Falcon de 15 ml	BD Faucon	352196	Articles en plastique
Anticorps monoclonaux CD27 biotinylés	Biolégende	302804	Clone O323
CD27 anti-humain biotinylé	Biolégende	302804	Clone O323
CD27 anti-humain biotinylé	eBiosciences	Référence 13-0279-80	Clone O323