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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Tri cellulaire pour la collecte de lymphocytes B naïfs, de lymphocytes B mémoires et de plasmablastes/plasmocytes (PB/PC)
- À l’aide de lymphocytes B du sang périphérique humain purifiés, déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
- Remettre les cellules en suspension dans un tampon PBS froid à la concentration de 10à 7 par mL dans un tube en polystyrène de 5 mL.
- Ajouter 1 à 2 μg d’IgG humaines pour 106 cellules et incuber sur glace pendant 10 minutes pour le bloc Fc.
- Ajouter 1 μg chacun d’anti-CD19-APC (clone : HIB19), d’anti-CD27-eFluor450 (clone : O323) et d’anti-CD38-PE (clone : HIT2) par 106 cellules ; bien mélanger et incuber sur glace pendant 30 min.
- Au cours des 5 dernières minutes, à l’étape 1.4, ajoutez 5 μL de 7-amino actinomycine D (7-AAD).
- Ajouter 2 mL de PBS dans le tube, le vortex et la centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min.
- Remettre les cellules en suspension dans un tampon de tri (PBS stérile avec 2 % de BSA et 2 mM d’EDTA) à une concentration de 1 à 5 x 107 cellules par mL dans un tube de 15 mL.
- Filtrez les cellules à travers une crépine cellulaire en maille de nylon (taille des pores de 40 μm) pour éliminer les amas cellulaires.
- Séparez les cellules à l’aide d’un trieur cytométrique en flux équipé de trois lasers : violet (405 nm), bleu (488 nm) et rouge (640 nm).
REMARQUE : Le laser bleu seul est suffisant pour la cytométrie en flux 3 couleurs.
- Triez les cellules dans trois tubes de 15 ml (contenant 5 ml de milieu RPMI) pour le prélèvement simultané de cellules B naïves (CD19+CD27-), de cellules B à mémoire (CD19+CD27+) et de PB/PC (CD19+CD27+/hiCD38+).
note: Les lymphocytes B naïfs et mémoires triés peuvent être cultivés davantage.