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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
Le sang périphérique humain doit être obtenu à partir de donneurs sains avec un consentement éclairé, et l’utilisation des échantillons de sang doit être conforme aux directives approuvées établies par les comités d’examen. Dans cette étude, le protocole d’utilisation du sang humain dans une démonstration des résultats de la cytométrie en flux (Figure 1) et des tests ELISpot (Figure 2).
1. Isolement et purification des lymphocytes B du sang périphérique humain
- Prélever ~ 10 ml de sang de la veine cubitale médiane (dans la fosse cubitale antérieure au coude) dans un tube de 15 ml contenant du K2EDTA (1,5 à 2,0 mg/ml de sang) et retourner immédiatement le tube plusieurs fois pour prévenir la formation de caillots.
- Ajouter 35 ml de tampon de lyse des globules rouges (GR) autoclavé (121 °C, 15 min) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 et 1 mM d’EDTA ; pH 7,4) dans le tube contenant l’échantillon de sang frais (≥ 3:1 vol/vol) et incuber à température ambiante (RT) pendant au plus 5 min.
note: L’apparition d’une transmission de la lumière à travers le tube indique la fin de la lyse des globules rouges.
- Centrifuger à 600 x g à RT pendant 5 min. Assurez-vous que la pastille est de couleur blanche.
- Remettre la pastille en suspension avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate autoclavée (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 et 1,47 mM KH2PO4 ; pH 7,4) et centrifuger comme à l’étape 1.3.
- Jeter le surnageant, remettre la pastille en suspension avec 10 mL de milieu RPMI 1640 (suppléments : 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine), puis déposer les cellules dans une boîte de culture de 10 cm (10 mL de sang par boîte). Placez le plat dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Agitez doucement la boîte de culture à quelques reprises et placez le milieu de culture (cellules de suspension) dans des tubes coniques en plastique de 15 ml. Jetez les cellules adhérentes (principalement des macrophages) sur les boîtes de culture.
- Centrifuger à 600 x g à RT pendant 5 min. Jeter le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension avec 1 mL de milieu RPMI 1640. Comptez le numéro de cellule à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
note: La viabilité des leucocytes isolés est normalement supérieure à 90 % à l’exclusion du bleu de trypan.
- Centrifuger comme à l’étape 1.7 et remettre les cellules en suspension dans ~ 200 μL de tampon PBS froid (0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’EDTA) à la concentration de 5 - 10 x 106 cellules/mL.
- Ajouter 5 μL de cocktail Ab biotinylé anti-humain spécifique aux cellules sanguines (pour la sélection négative des lymphocytes B) par 10à 6 cellules et incuber sur glace pendant 30 min.
note: Le cocktail d’anticorps anti-humains doit au moins inclure des Abdominaux spécifiques aux CD2 (ou CD3), CD14 et CD16.
- Ajouter un volume excédentaire de 10 fois plus de PBS stérile dans les cellules, centrifuger à 600 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Ajoutez des quantités égales de microbilles conjuguées à la streptavidine (5 μL par 10à 6 cellules) à la pastille et mélangez soigneusement.
- Incuber sur glace pendant 30 min dans un tube conique en plastique de 15 ml.
- Ajoutez 2 ml de tampon PBS dans le tube.
- Placez le tube dans un support magnétique et incubez à RT pendant 8 min. Les microbilles brunes se fixeront progressivement à la paroi du tube à côté de l’aimant.
- Avec le tube restant dans le support magnétique, transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube stérile de 15 ml.
- Répétez les étapes 1.14 à 1.16 et combinez les deux surnageants qui contiennent les lymphocytes B intacts. Jetez les microbilles.
- Centrifuger à 600 x g à RT pendant 5 min. Jeter le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans un milieu RPMI 1640 pour les expériences en aval.
note: En règle générale, 1 à 5 x 10cellules B 5 d’une pureté supérieure à 95 % à partir de 10 ml de sang périphérique peuvent être isolés.
2. Purification et séparation des lymphocytes B mémoires et naïfs des lymphocytes B isolés
- Utilisez des cellules purifiées à partir de l’étape 1 et déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon PBS froid après centrifugation à 600 x g et RT pendant 5 min.
- Ajouter 1 à 2 μg de CD27 mAb biotinylé par 106 cellules et incuber sur glace pendant 30 min.
- Ajouter 10 mL de tampon PBS dans le tube et centrifuger à 600 x g pendant 5 min.
- Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 50 μL de tampon PBS.
- Ajoutez des quantités égales de microbilles magnétiques de streptavidine (1 à 2 μg/10 6 cellules) aux cellules dans un tube conique en plastique de 15 ml.
- Bien mélanger délicatement et incuber sur glace pendant 30 min.
- Ajoutez 2 à 3 ml de tampon PBS dans le tube.
- Placez le tube dans un support magnétique et incubez à RT pendant 8 min pour permettre aux microbilles brunes de se fixer du côté le plus proche de l’aimant.
- Avec le tube dans le support magnétique, transférez soigneusement la fraction surnageante dans un nouveau tube stérile. Cette fraction contient les lymphocytes B enrichis naïfs de CD27.
- Ajouter 5 mL dans le tube contenant les microbilles et remettre doucement en suspension les microbilles (c.-à-d. la fraction enrichie des lymphocytes B à mémoire CD27+).
- Centrifugeuse à 600 x g à RT pendant 5 min. Remettre les pastilles en suspension avec le milieu RPMI 1640 pour les expériences en aval.
note: En règle générale, ~ 30 à 60 % des lymphocytes B peuvent être purifiés en tant que cellules mémoires CD27+ à partir des PBMC d’un donneur sain.
3. Tri des cellules pour la collecte de cellules B naïves, de cellules B à mémoire et de PBs/PC
- À l’aide des cellules purifiées à partir de l’étape 1, déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
- Remettre les cellules en suspension dans un tampon PBS froid à la concentration de 10à 7 par mL dans un tube en polystyrène de 5 mL.
- Ajouter 1 à 2 μg d’IgG humaines pour 106 cellules et incuber sur glace pendant 10 minutes pour le bloc Fc.
- Ajouter 1 μg chacun d’anti-CD19-APC (clone : HIB19), d’anti-CD27-eFluor450 (clone : O323) et d’anti-CD38-PE (clone : HIT2) par 106 cellules ; bien mélanger et incuber sur glace pendant 30 min.
- Au cours des 5 dernières minutes, à l’étape 3.4, ajoutez 5 μL de 7-amino actinomycine D (7-AAD).
- Ajouter 2 mL de PBS dans le tube, le vortex et la centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min.
- Remettre les cellules en suspension dans un tampon de tri (PBS stérile avec 2 % de BSA et 2 mM d’EDTA) à une concentration de 1 à 5 x 107 cellules par mL dans un tube de 15 mL.
- Filtrez les cellules à travers une crépine cellulaire en maille de nylon (taille des pores de 40 μm) pour éliminer les amas cellulaires.
- Séparez les cellules à l’aide d’un trieur cytométrique en flux équipé de trois lasers : violet (405 nm), bleu (488 nm) et rouge (640 nm).
note: Le laser bleu seul est suffisant pour la cytométrie en flux 3 couleurs.
- Triez les cellules dans trois tubes de 15 ml (contenant 5 ml de milieu RPMI) pour le prélèvement simultané de cellules B naïves (CD19+CD27-), de cellules B à mémoire (CD19+CD27+) et de PB/PC (CD19+CD27+/hiCD38+).
note: Les lymphocytes B naïfs et mémoires triés peuvent être cultivés comme décrit à l’étape 4.
4. Différenciation in vitro des lymphocytes B CD19+ humains isolés, des lymphocytes B mémoires CD19+CD27+ et des lymphocytes B naïfs CD19+CD27-
- À l’aide des cellules purifiées aux étapes 1.19, 2.10, 2.11 et 3.10, déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
- Remettre les cellules en suspension avec le milieu RPMI 1640 à une concentration de 1 à 10 x 105 par mL et les aliquoter dans les puits d’une plaque à 12 puits.
- Ajouter CpG (ODN 2006) à 5 μg/106 cellules/mL.
- Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 5 jours.
- Récoltez les cellules de chaque puits, placez-les séparément dans des tubes de 15 ml, ajoutez 5 ml de PBS dans chaque tube et centrifugez-les à 600 x g et RT pendant 5 min.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules. Remettre les cellules en suspension à une concentration de 1 à 10 x 105 par mL avec le milieu RPMI 1640.
5. Dosage ELISpot
- Ajouter 30 μL d’éthanol à 35 % dans de l’eau distillée dans chaque puits des plaques ELISpot pendant 30 s.
note: Lors du pipetage, évitez de toucher la membrane des puits en tout temps.
- Retournez les plaques ELISpot pour retirer l’éthanol.
- Mettez 150 μL de ddH2O autoclavé dans chaque puits et incubez-les à RT pendant 5 min pour éliminer l’éthanol résiduel ; poursuivez avec un lavage de PBS stérile à RT pendant 3 min
note: Les étapes 5.1 à 5.3 peuvent être facultatives, en fonction de la fabrication des plaques.
- Placez 50 μL de 5 μg/mL de fragment polyclonal F(ab')2 d'Ig anti-humaines (IgG + IgM + IgA) (en PBS) dans chaque puits des plaques ELISpot et incubez-les à 4 °C pendant la nuit (de préférence) ou à 37 °C pendant 2 h.
note: Scellez les bords des plaques avec du Parafilm jusqu’à utilisation.
- Retournez les plaques pour éliminer les Abs non liés, ajoutez 200 μL de PBS dans chaque puits et incubez-les deux fois à RT pendant 3 minutes à chaque fois.
- Ajouter 200 μL de PBS avec 5 % de BSA (ou milieu RPMI 1640) dans chaque puits pour le blocage, et les incuber à RT pendant 2 h.
- Retournez les plaques pour retirer le tampon de blocage. Lavez chaque puits deux fois avec 200 μL de PBS, comme à l’étape 5.5.
- Ajouter 100 μL de milieu RPMI 1640 dans chaque puits et les incuber à 37 °C.
- Lorsque vous êtes prêt à ensemencer les cellules, retournez les plaques pour retirer le milieu RPMI 1640.
- Insérez 100 μL (5 x 104), 50 μL (2,5 x 104) et 25 μL (1,25 x 104) des cellules (à partir des étapes 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 et 4.6) dans les puits d’une plaque ELISpot. Avec le fluide RPMI 1640, porter le volume à 150 μL/puits.
note: Il est recommandé d’utiliser au moins une ou deux dilutions en série en 2 fois pour le placage des cellules.
- Incuber les plaques dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 8 à 14 h. Évitez de déplacer les plaques pendant l’incubation.
- Inversez les plaques pour retirer les cellules et le milieu RPMI 1640.
- Ajouter 200 μL/puits de PBS-T (PBS avec 0,05 % de Tween 20) et les incuber 5 fois à RT, chaque fois pendant 3 min. Retourner la plaque pour retirer le tampon de lavage entre chacun des 5 lavages.
- Ajouter soit de la phosphatase alcaline (AP) IgG de chèvre, soit de l’Abs spécifique à Fcγ (pour la détection des IgG, 1:5 000 dans le PBS-T) soit de l’IgM-AP anti-humaine de chèvre, de l’Abs spécifique au fragment Fcμ (pour la détection des IgM, 1:5 000 dans le PBS-T) dans les puits désignés et incuber à RT pendant 2 h dans l’obscurité.
- Lavez chaque puits deux fois avec 200 μL de PBS, comme à l’étape 5.5.
- Ajouter 50 μL/puits de solution de substrat de phosphate de bromochloroindolyle-nitro bleu tétrazolium (BCIP/NBT). Les taches de couleur violette apparaissent normalement en 5 à 15 minutes.
- Ajouter 100 μL/puits de ddH2O pour éviter le développement excessif de taches.
- Rincez les plaques à l’eau courante du robinet après le développement complet de toutes les taches.
- Retirez le drain inférieur des plaques et laissez-les sécher à l’air libre dans l’obscurité.
- Comptez les taches à l’aide d’un lecteur de plaques automatisé doté d’une unité d’acquisition/d’analyse d’images (par exemple, un scanner automatique ou manuellement via un microscope de dissection).
note: Les plaques peuvent être stockées à RT dans l’obscurité et analysées ultérieurement.
