Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Récolte d’os de souris
- Euthanasier les animaux à l’aide deCO2 suivi d’une luxation cervicale et les vaporiser avec de l’éthanol à 70 %.
note: Assurez-vous d’utiliser des animaux du même sexe et de préférence du même âge. Nous utilisons régulièrement des animaux âgés de 7 à 8 semaines. Nous recommandons de regrouper les cellules d’au moins 3 animaux par groupe expérimental pour obtenir une population cellulaire mieux représentative et reproductible.
- Placez la souris euthanasiée sur son dos sur une planche de dissection. Utilisez des pinces pour créer une tente de peau sur l’abdomen. Faites une petite incision (environ 1 cm) à l’aide de ciseaux de dissection stériles. Retirez la peau vers les membres et les pieds de la coupure afin d’exposer le bas-ventre et les jambes.
- Coupez sous l’articulation de la cheville pour retirer le pied. Coupez le long de la crête iliaque au niveau de la hanche pour séparer la tête du fémur de l’os de la hanche. Pendant que la souris est encore sur le dos, faites une incision au milieu de l’os de la hanche pour séparer les deux os iliaques.
- À l’aide de lingettes non pelucheuses, retirez soigneusement le muscle des fémurs, des tibias et des os iliaques.
note: En coupant autant de tendons et de muscles que possible de l’os, le nettoyage est plus rapide et plus facile avec les lingettes non pelucheuses (par exemple, les lingettes Kim). Soyez prudent lorsque vous manipulez les os car ils ont tendance à se briser facilement et leur fragilité peut être augmentée avec certains génotypes.
- Une fois que tous les échantillons ont été disséqués, placez-les dans du PBS sur de la glace et placez-les dans une hotte de culture stérile pour les étapes restantes de l’isolement.
note: Travailler de manière aseptique autant que possible réduira le risque de contamination dans les cultures.
- Faites de petites incisions (environ 1 à 2 mm) aux extrémités proximale et distale des os avant de les placer dans les pointes sectionnées à l’intérieur des tubes à centrifuger.
note: Assurez-vous de couper une quantité suffisante pour que la moelle puisse être centrifugée ; Cependant, il faut veiller à ne pas trop couper car les populations cellulaires ont tendance à varier en fonction de la proximité dans l’espace de la moelle.
- Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 15 s à température ambiante. Assurez-vous que toute la moelle est rincée et granulée au fond du tube de 1,5 mL tandis que les os sont à l’intérieur des inserts (soit une pointe de pipette de 200 μL, soit un tube de microcentrifugation de 0,75 mL). Une fois toute la moelle recueillie, retirez les inserts avec les os des tubes de prélèvement.
note: Si toute la moelle est rincée, les os apparaîtront blancs. Cependant, si la moelle osseuse reste dans certains os, essayez à nouveau de couper les extrémités et de centrifuger.
2. Suspension cellulaire
- À l’aide d’une aiguille de 25 g, tirez lentement les pastilles de cellules de haut en bas pour briser les amas et combinez tous les échantillons en un seul tube conique de 15 ml. Ajouter 10 mL de milieu de culture BMSC par 500 μL d’échantillons.
- Placez un filtre de 70 μm sur un tube conique de 50 ml et faites passer la suspension cellulaire à travers ce filtre afin d’éliminer d’éventuels fragments d’os.
3. Placage et culture de populations mixtes de cellules de moelle osseuse (BMC totaux)
REMARQUE : Les cellules sont cultivées à 37 °C dans un incubateur avec 5 % de CO2.
- Calculez le nombre de cellules et plaquez-les à 1,0 x 106 cellules/cm2 dans un milieu de culture. Laisser 72 h de culture mixte pour que les cellules se fixent.
note: Nous recommandons de diluer la suspension cellulaire 20 fois dans un milieu de culture et de la diluer à nouveau dans du bleu de trypan avant de compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour les souris mâles C57Bl6/J âgées de 7 semaines, nous donnons régulièrement un nombre de cellules d’environ 50 x 106 cellules, mais l’âge, le sexe et la souche peuvent affecter considérablement le nombre de cellules.
note: Une population mixte de cellules doit bien se fixer au fond de la culture.
- Après 72 h, retirez le support et remplacez-le par un support frais. Continuez à changer de support tous les deux jours et vérifiez la confluence. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 100 %, elles sont prêtes pour la différenciation.
note: Parce que cette culture est mélangée avec des BMSC et des HSC, elle peut être directement utilisée pour l’ostéoblastogenèse, l’adipogenèse ainsi que l’ostéoclastogenèse.
4. Placage et culture de la population divisée de BMSC (BMSC adhérents)
REMARQUE : Les cellules sont cultivées à 37 °C dans un incubateur avec 5 % de CO2.
- Placez toutes les cellules prélevées sur les fémurs, les tibias et les os iliaques d’une souris dans une boîte de culture de 10 cm (55 cm2 de surface de culture).
note: Lors de l'intégration de 2 à 3 souris C57BL/6J, nous plaçons généralement cette population « totale » de moelle osseuse dans une fiole de150 cm 2.
- Après 48 h de culture mixte, retirer le milieu de culture (contenant les CSH non adhérentes). Si des expériences d’ostéoclastogenèse doivent être réalisées, mettre de côté cette population de cellules non adhérentes (voir rubrique 7), sinon, aspirer et jeter ces cellules.
- Lavez soigneusement la plaque/le ballon avec du PBS afin de ne pas déranger les cellules attachées.
- Retirez le PBS et soulevez les cellules en ajoutant 0,25 % de trypsine et en laissant incuber à 37 °C pendant 1 à 3 min. Trempez la trypsine en ajoutant du milieu cellulaire à la suspension cellulaire. À ce stade, les BMSC, qui sont maintenant levés, peuvent être comptés (comme cela a été fait précédemment à l’étape 4.1) et plaqués pour de futures expériences.
- Calculez le nombre de cellules nécessaires pour le placage. Centrifuger le volume requis de suspension cellulaire à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
note: Les cellules sont généralement plaquées sur la base d’expériences finales. Par exemple, si une protéine/ARN doit être isolée, nous plaquons généralement à une densité plus élevée (~1,0-2,0 x 106 cellules/puits dans une plaque à 6 puits).
- Retirez le milieu et remettez la pastille en suspension dans le volume de milieu de culture nécessaire au placage. Placez les cellules dans un milieu de culture selon les expériences et laissez-les se fixer pendant quelques jours. Lorsque les BMSC atteignent la confluence, procédez à la différenciation.
