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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des tubes de collecte
- Préparez le milieu de culture BMSC en complétant le milieu essentiel minimum α (MEM α) avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine.
- Placez 100 μL de milieu de culture BMSC dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. 3 os tiennent généralement dans un seul tube, alors préparez-vous en conséquence.
- Coupez les extrémités des pointes de pipette de 200 μL suffisamment pour qu’elles s’insèrent dans les tubes de centrifugation. Insérez les embouts à l’intérieur des tubes et assurez-vous que les couvercles peuvent se fermer avant de placer les tubes sur de la glace.
note: Alternativement, des tubes de microcentrifugation de 0,75 mL avec les extrémités coupées peuvent être insérés dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
2. Récolte d’os de souris
- Euthanasier les animaux à l’aide deCO2 suivi d’une luxation cervicale et les vaporiser avec de l’éthanol à 70 %.
note: Assurez-vous d’utiliser des animaux du même sexe et de préférence du même âge. Nous utilisons régulièrement des animaux âgés de 7 à 8 semaines. Nous recommandons de regrouper les cellules d’au moins 3 animaux par groupe expérimental pour obtenir une population cellulaire mieux représentative et reproductible.
- Placez la souris euthanasiée sur son dos sur une planche de dissection. Utilisez des pinces pour créer une tente de peau sur l’abdomen. Faites une petite incision (environ 1 cm) à l’aide de ciseaux de dissection stériles. Retirez la peau vers les membres et les pieds de la coupure afin d’exposer le bas-ventre et les jambes.
- Coupez sous l’articulation de la cheville pour retirer le pied. Coupez le long de la crête iliaque au niveau de la hanche pour séparer la tête du fémur de l’os de la hanche. Pendant que la souris est encore sur le dos, faites une incision au milieu de l’os de la hanche pour séparer les deux os iliaques.
- À l’aide de lingettes non pelucheuses, retirez soigneusement le muscle des fémurs, des tibias et des os iliaques.
note: En coupant autant de tendons et de muscles que possible de l’os, le nettoyage est plus rapide et plus facile avec les lingettes non pelucheuses (par exemple, les lingettes Kim). Soyez prudent lorsque vous manipulez les os car ils ont tendance à se briser facilement et leur fragilité peut être augmentée avec certains génotypes.
- Une fois que tous les échantillons ont été disséqués, placez-les dans du PBS sur de la glace et placez-les dans une hotte de culture stérile pour les étapes restantes de l’isolement.
note: Travailler de manière aseptique autant que possible réduira le risque de contamination dans les cultures.
- Faites de petites incisions (environ 1 à 2 mm) aux extrémités proximale et distale des os avant de les placer dans les pointes sectionnées à l’intérieur des tubes à centrifuger.
note: Assurez-vous de couper une quantité suffisante pour que la moelle puisse être centrifugée ; Cependant, il faut veiller à ne pas trop couper car les populations cellulaires ont tendance à varier en fonction de la proximité dans l’espace de la moelle.
- Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 15 s à température ambiante. Assurez-vous que toute la moelle est rincée et granulée au fond du tube de 1,5 mL tandis que les os sont à l’intérieur des inserts (soit une pointe de pipette de 200 μL, soit un tube de microcentrifugation de 0,75 mL). Une fois toute la moelle recueillie, retirez les inserts avec les os des tubes de prélèvement.
note: Si toute la moelle est rincée, les os apparaîtront blancs. Cependant, si la moelle osseuse reste dans certains os, essayez à nouveau de couper les extrémités et de centrifuger.
3. Suspension cellulaire
- À l’aide d’une aiguille de 25 g, tirez lentement les pastilles de cellules de haut en bas pour briser les amas et combinez tous les échantillons en un seul tube conique de 15 ml. Ajouter 10 mL de milieu de culture BMSC par 500 μL d’échantillons.
- Placez un filtre de 70 μm sur un tube conique de 50 ml et faites passer la suspension cellulaire à travers ce filtre afin d’éliminer d’éventuels fragments d’os.
4. Placage et culture de populations mixtes de cellules de moelle osseuse (BMC totaux)
REMARQUE : Les cellules sont cultivées à 37 °C dans un incubateur avec 5 % de CO2.
- Calculez le nombre de cellules et plaquez-les à 1,0 x 106 cellules/cm2 dans un milieu de culture. Laisser 72 h de culture mixte pour que les cellules se fixent.
note: Nous recommandons de diluer la suspension cellulaire 20 fois dans un milieu de culture et de la diluer à nouveau dans du bleu de trypan avant de compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour les souris mâles C57Bl6/J âgées de 7 semaines, nous donnons régulièrement un nombre de cellules d’environ 50 x 106 cellules, mais l’âge, le sexe et la souche peuvent affecter considérablement le nombre de cellules.
note: Une population mixte de cellules doit bien se fixer au fond de la culture.
- Après 72 h, retirez le support et remplacez-le par un support frais. Continuez à changer de support tous les deux jours et vérifiez la confluence. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 100 %, elles sont prêtes pour la différenciation.
note: Parce que cette culture est mélangée avec des BMSC et des HSC, elle peut être directement utilisée pour l’ostéoblastogenèse, l’adipogenèse ainsi que l’ostéoclastogenèse.
5. Placage et culture de la population divisée de BMSC (BMSC adhérents)
REMARQUE : Les cellules sont cultivées à 37 °C dans un incubateur avec 5 % de CO2.
- Placez toutes les cellules prélevées sur les fémurs, les tibias et les os iliaques d’une souris dans une boîte de culture de 10 cm (55 cm2 de surface de culture).
note: Lors de l'intégration de 2 à 3 souris C57BL/6J, nous plaçons généralement cette population « totale » de moelle osseuse dans une fiole de150 cm 2.
- Après 48 h de culture mixte, retirer le milieu de culture (contenant les CSH non adhérentes). Si des expériences d’ostéoclastogenèse doivent être réalisées, mettez de côté cette population de cellules non adhérentes, sinon, aspirez et jetez ces cellules.
- Lavez soigneusement la plaque/le ballon avec du PBS afin de ne pas déranger les cellules attachées.
- Retirez le PBS et soulevez les cellules en ajoutant 0,25 % de trypsine et en laissant incuber à 37 °C pendant 1 à 3 min. Trempez la trypsine en ajoutant du milieu cellulaire à la suspension cellulaire. À ce stade, les BMSC, qui sont maintenant levés, peuvent être comptés (comme cela a été fait précédemment à l’étape 4.1) et plaqués pour de futures expériences.
- Calculez le nombre de cellules nécessaires pour le placage. Centrifuger le volume requis de suspension cellulaire à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
note: Les cellules sont généralement plaquées sur la base d’expériences finales. Par exemple, si une protéine/ARN doit être isolée, nous plaquons généralement à une densité plus élevée (~1,0-2,0 x 106 cellules/puits dans une plaque à 6 puits).
- Retirez le milieu et remettez la pastille en suspension dans le volume de milieu de culture nécessaire au placage. Placez les cellules dans un milieu de culture selon les expériences et laissez-les se fixer pendant quelques jours. Lorsque les BMSC atteignent la confluence, procédez à la différenciation.
6. Différenciation des BMSC
- Adipocytes
- Préparez un milieu adipocytaire en mélangeant 90 ml de milieu à haute teneur en glucose Dulbecco Modified Eagle (DMEM), 10 ml de sérum fœtal bovin, 1 ml de pénicilline/streptomycine, 100 μL de rosiglitazone 20 mM et 100 μL d’insuline 2 mM. Si nécessaire, stockez ce milieu à 4 °C pendant la semaine pendant l’expérience de différenciation.
- Préparez un milieu d’induction adipocytaire en ajoutant 200 μL de 62,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) et 25 μL de 1 mM de dexaméthasone à 25 mL de milieu de base adipocytaire.
- Une fois que les cultures de BMSC (BMCs totales de l’étape 4.3 ou BMSC adhérentes de l’étape 5.6) sont confluentes, changer le milieu en milieu d’induction adipocytaire. Considérez ce Jour 0 de différenciation.
- Après 48 h, retirer le milieu et rafraîchir la culture avec un milieu d’induction adipocytaire.
- Le jour 4, passez à la base adipocytaire media.
note: Les gouttelettes lipidiques peuvent commencer à apparaître dès le jour 2 ou le jour 4.
- Au jour 7, observez que les cellules ont accumulé un maximum de gouttelettes lipidiques et présentent un phénotype similaire à celui d’un adipocyte mature. Ne cultivez pas au-delà de ce point, car cela pourrait entraîner la mort ou le détachement des cellules.