Isolement de cellules T basé sur la flottation à l’aide d’un tri cellulaire activé par flottabilité

Résumé

Source : Snow, T., et al. Isolement, activation et expansion des lymphocytes T basés sur la flottation à partir d’échantillons de cellules mononucléées de sang périphérique humain à l’aide de microbulles. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre l’isolement des lymphocytes T à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à l’aide de la technologie de tri cellulaire activé par flottabilité fonctionnalisée (BACS). La technique d’isolement implique la sélection positive des lymphocytes T CD3+ en marquant les cellules avec des anticorps anti-CD3 biotinylés et en séparant les cellules liées aux anticorps à l’aide de microbulles liées à la streptavidine.

Protocole

1. Isolement des lymphocytes T avec des microbulles par sélection positive

REMARQUE : Ce protocole détaille une approche de sélection positive CD3⁺ à petite échelle utilisant des SAMBs.

1. Incuber 3 x 10⁸ PBMC obtenus commercialement dans 2,5 mL de tampon de séparation avec un anticorps anti-CD3 biotinylé (OKT3) à une concentration de 25 ng d’anticorps par 1 million de cellules (25 ng/M). Mélangez doucement en pipetant de haut en bas et incubez à température ambiante pendant 10 min.
2. Ajouter des microbulles de streptavidine (SAMB) dans un rapport de 0,5 (quantité de SAMB) : 1 (quantité de cellules) selon la concentration de SAMB déclarée par le fabricant.
3. Mélanger à l’aide d’un rotateur commercial à 20 tr/min pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g à température ambiante.
4. Après la centrifugation, les cellules sélectionnées positivement seront au sommet de la suspension avec les SAMBs. Les cellules non sélectionnées restantes seront dans la pastille de cellule au fond du tube. À l’aide d’une pipette en verre de 9 pouces, insérez la pointe sous la couche de cellules à bulles au fond du tube, aspirez la pastille de cellule et le sous-nageant avec une pipette électronique et transférez-les dans un nouveau tube.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-CD3 humain à la biotine (OKT3)	Biolégende	Référence 317320
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
PBMC humains normaux	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Kit de microbulles de streptavidine (comprend le tampon de séparation d'Akadeum)	Akadeum	Référence 11110-000