Culture de lymphocytes T activés à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain

Résumé

Source : Mølgaard, K., et al. Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les lymphocytes T primaires humains différenciés par cytokines. J. Vis. Exp. (2021).

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole pour l’activation des lymphocytes T primaires humains. L’incubation de lymphocytes T naïfs avec des billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28, suivie d’un traitement à l’interleukine-2 ou à l’interleukine-15, conduit à l’activation des lymphocytes T naïfs, à leur différenciation et à leur prolifération en lymphocytes T effecteurs ou à mémoire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Culture de lymphocytes T primaires humains activés

1. Décongélation des cellules (Jour 1)
   1. Préchauffer 10 ml de RPMI 1640 par échantillon à environ 37 °C.
   2. Prélevez le nombre souhaité d’ampoules de cellules mononucléées du sang périphérique et rangez-les temporairement sur de la glace sèche.
   3. Remettre en suspension les cellules congelées dans 10 mL de RPMI 1640 préchauffé.
   4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g à RT.
   5. Jeter le surnageant et laver à nouveau les cellules en les remettant en suspension dans 10 mL de RPMI 1640 et en les centrifugeant comme décrit à la section 1.1.4.
   6. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension à raison de 2 x 10⁶ cellules par mL de milieu X-VIVO 15 + 5 % de sérum humain (ci-après : milieu de cellules T).
   7. Déposer 2 mL de cellules par puits dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits et incuber pendant une nuit à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Activation des cellules (Jour 0)
   1. Laver les billes de CD3/CD28 en transférant 12,5 μL de billes par 1 million de cellules dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 12,5 μL de PBS par 12,5 μL de billes.
      note: Il est important de vortex le flacon de perles avant utilisation.
   2. Placez le tube de microcentrifugation sur un aimant approprié pendant 1 min.
   3. Jetez le tampon et mettez les billes en suspension dans le volume d’origine du milieu des cellules T (12,5 μL de milieu des cellules T pour 12,5 μL du volume d’origine des billes).
   4. Ajouter 12,5 μL de billes par million de cellules correspondant à un rapport de 1:2 (billes : cellules).
   5. Divisez les cellules en deux conditions avec environ 5 millions de cellules dans chacune.
   6. Ajoutez le volume correct de cytokines aux conditions mentionnées dans le tableau 1.
   7. Incuber les cellules pendant 3 jours à 37 °C et 5 % de CO₂.
3. Culture des cellules (jours 3 et 5)
   1. Remettez les cellules en suspension et divisez-les en transférant la moitié du volume de chaque puits dans un nouveau puits. Ajoutez le même volume de milieu de cellules T frais dans chaque puits.
   2. Ajoutez de nouvelles cytokines à chaque affection comme mentionné dans le tableau 1.

	Cytokines	stock	Facteur de dilution	final
Condition 1	L’IL-2	3 x 106 U/mL	30 000	100 U/mL
Condition 2	L’IL-15	2 x 105 U/mL	2 000	100 U/mL

Tableau 1 : Préparation de cultures de cytokines utilisées pour guider les changements métaboliques dans les lymphocytes T.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture tissulaire à 24 puits	Nunc	142485
Perles anti-CD3xCD28	Gibco	11161D
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
Sérum Humain	Sigma Aldrich	N° H4522	Chaleur inactivée à 56 °C pendant 30 min
L’IL-15	Peprotech	Référence 200-02
L’IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Technologies des cellules souches	Référence 7801
Pbs	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Aimant à billes T DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	Référence 12321D