Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement de cellule unique à partir de PDLN
- Placez un treillis métallique stérile de 250 μm sur un tube conique de 15 mL dans un support. Rincez le filet avec 1 mL de RPMI.
- Transférez les ganglions lymphatiques dans le treillis métallique et broyez-les à travers le treillis à l’aide d’une pince à épiler. Appliquez 1 mL de RPMI sur le treillis métallique pour rincer les cellules dans le tube. Répétez l’opération 3 fois de plus et retirez le treillis.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans environ 5 mL de RPMI. Remplissez les tubes avec du RPMI.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans environ 5 mL de RPMI. Remplissez les tubes avec du RPMI.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de RPMI. Transférer 2 mL de suspension cellulaire dans des tubes à fond rond de 5 mL munis d’un capuchon de crépine de cellule. Appliquez la suspension cellulaire sur les capuchons de la crépine de la cellule.
2. Cytométrie en flux
- Centrifuger les suspensions cellulaires des PDLN à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Colorez les cellules avec les anticorps de surface suivants dans 100 μL de tampon de coloration par cytométrie en flux (tampon FACS) : 0,75 μg/100 μL d’anticorps CD4 conjugué à la FITC, 0,60 μg/100 μL d’anticorps CD8 conjugué à l’APC-H7, 0,30 μg/100 μL d’anticorps CD25 conjugué au PE, 5 μL (1:20) d’anticorps Nrp1 conjugué à l’APC. Incuber les tubes sur de la glace pendant 40 min.
- Ajoutez 200 μL de tampon FACS dans chaque tube. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant. Répétez l’opération une fois de plus.
- Fixer et perméabiliser les cellules en remettant en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon de fixation de perméabilisation (PFB).
note: Le PFB est préparé en mélangeant 1 partie de concentré de fixation/perméabilisation avec 3 parties de diluant de fixation/perméabilisation.
- Conservez les tubes au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit.
note: Une incubation de 1 h fonctionne également.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon de lavage de perméabilisation (PWB). Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
note: Le PWB est préparé en diluant le tampon de perméabilisation (10x) à 1:10 dans de l’eau distillée.
- Colorez les cellules avec les anticorps intracellulaires suivants dans 100 μL de PWB : 0,30 μg/100 μL d’anticorps Foxp3 conjugué au PE-Cy7, 4 μL (1:25) d’anticorps Helios conjugué au PacificBlue. Incuber les tubes sur de la glace pendant 1 h.
- Ajouter 500 μL de PWB dans chaque tube. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de PWB. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille de cellule dans 300 μL de tampon FACS.
- Analysez les cellules sur un cytomètre en flux.
- Contrôlez les cellules individuelles en fonction de la zone de diffusion latérale, de la hauteur et de la largeur, ainsi que de la zone de diffusion directe, de la hauteur et de la largeur. Exécutez un million d’événements à des fins d’analyse.
- Exportez les fichiers FCS des expériences et analysez-les à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux.
