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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Différenciation des mégacaryocytes
- Semez 5 × 10 cellules CD34+ de5 cellules/ml dans 2 mL de SFM complétées par 50 ng/mL de thrombopoïétine humaine recombinante (rhTPO) par puits dans une plaque de 12 puits. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Si les cellules sont confluentes avant d’être nécessaires à l’analyse, récoltez-les et divisez-les en plusieurs puits avec des milieux frais et rhTPO.
note: Deux ou trois puits doivent être préparés spécifiquement pour surveiller la différenciation à différents moments (par exemple, les jours 7, 9 et 10).
- Récoltez les cellules des puits réservés pour surveiller la différenciation sans perturber les cellules des autres puits.
- Cellules tachatives avec 20 μL d’anticorps anti-GPIIb/CD41-FITC et 10 μL d’anticorps anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 dans un volume final de 100 μL. Mettez en place un tube de contrôle à l’aide des anticorps de contrôle d’isotype respectifs. Incuber pendant 15 à 30 min à 4 °C.
- Ajouter 1 mL de SB pour laver. Centrifugeuse à 400 × g pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 200 à 300 μL de SB. Analyser par cytométrie en flux.
- Pour chaque fluorophore, analysez les contrôles d’isotype afin de définir le gating pour les populations positives FITC et Alexa Flour 647. Analysez les échantillons de cellules colorées pour déterminer le pourcentage de cellules CD41+/CD42a+ doublement positives, qui représentent des MK matures (Figure 1C).
- Pour la visualisation microscopique des marqueurs de surface cellulaire, colorer les cellules comme décrit en 1.3.
- Ajouter 1 mL de SB pour laver. Centrifugeuse à 400 × g pendant 10 min. Remettre la pastille en suspension dans 100 μL de SB et la faire tourner sur une lame de verre à 1 000 x g pendant 5 min. Fixez les cellules sur la lame en les trempant dans du méthanol pendant 30 s. Sécher à l’air, ajouter 20 μL de support de montage contenant du DAPI (voir le tableau des matériaux), couvrir avec une lamelle de recouvrement et visualiser à l’aide d’un microscope fluorescent (Figure 2A).
- Pour la visualisation des antigènes intracellulaires, remettre les cellules en suspension dans le PBS et les fixer avec du paraformaldéhyde (concentration finale de 1 %) pendant 15 min à température ambiante. Pour perméabiliser les cellules, ajoutez du triton-X 100 (0,1 %) et incubez pendant 15 min. Laver les cellules avec 2 mL de PBS/0,1 % de triton-X 100. Remettre en suspension dans 100 μL de PBS/triton-X 100 à 0,1 %, ajouter des anticorps anti-vWf et anti-CD62p (dilution 1:200) et incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Laver avec 2 mL de PBS/0,1 % de triton-X 100 et centrifuger à 400 × g pendant 10 min, remettre en suspension dans 100 μL du même tampon et ajouter l’IgG-Alexa 594 anti-souris et l’IgG-Alexa 488 anti-lapin (1:100). Incuber pendant 30 minutes à température ambiante, laver avec 2 mL de PBS/0,1 % de triton-X 100, remettre en suspension dans 100 μL du même tampon et ajouter 20 μL d’anti-CD42b-APC. Ensuite, faites tourner les cellules sur des lames de verre comme décrit à l’étape 1.6.1 et préparez les échantillons pour la visualisation microscopique comme décrit à l’étape 1.6.1.
- Pour la détermination de la ploïdie, prélever les cellules aux jours 12 ou 13 de la différenciation. Ajouter 1 mL de SB pour laver. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min et colorer avec 20 μL d’anticorps anti-GPIIb/CD41-FITC dans un volume final de 100 μL. Incuber à 4 °C pendant 30 min.
- Laver une fois avec 1 mL de SB et remettre la pastille en suspension dans 300 μL de tampon de citrate hypotonique (1,25 mM de citrate de sodium, 2,5 mM de chlorure de sodium, 3,5 mM de dextrose) contenant 20 μg/ml d’iodure de propidium et 0,05 % de Triton-X 100. Incuber pendant 15 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
- Ajouter la RNase à une concentration finale de 20 μg/mL et incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière. Déterminer l’intensité de l’iodure de propidium par cytométrie en flux en recueillant 30 000 à 50 000 événements de la population CD41-FITC+ (Figure 2C).
2. Numération des proplaquettes, dénombrement des plaquettes et activation plaquettaire
- Récolter les cellules (à partir de l’étape 1.1) aux jours 8 ou 9 de la différenciation et semer à 1 × 10 4 cellules/puits dans des plaques de 48 puits dans 200 μL de SFM frais complété par 50 ng/mL de rhTPO. Culture pendant 5 jours à 37 °C, 5 % CO2.
note: À des fins de quantification, les puits de semences sont en trois exemplaires. Cette faible densité est nécessaire pour la visualisation et le comptage des MK porteurs de proplaquettes. Les proplaquettes commencent généralement à apparaître après 2 jours de culture. Le pic se situe entre les jours 4 et 5.
- Comptez le nombre de MK porteurs de proplaquettes dans l’ensemble du puits sur un microscope à lumière inversée à l’aide d’objectifs 10X ou 20X.
note: Une platine de microscope chauffée (37 °C) est préférable car le maintien des cellules à température ambiante pendant de longues périodes entraîne un rétrécissement des extensions proplaquettaires. Les proplaquettes sont observées comme de longues extensions du corps MK. Chaque MK peut avoir plusieurs protubérances proplaquettes. Au fur et à mesure que les proplaquettes se développent, le corps du MK diminue en taille.
- Récoltez les cellules et centrifugez à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Cellules tachatives avec un anticorps anti-CD41-FITC humain de 20 μL, comme décrit aux étapes 1.3 et 1.4. Calculer le pourcentage de MK porteurs de proplaquettes (pbMK) :
pbMK ( %) = [(MK porteurs de proplaquettes/puits) / (Nombre total de cellules CD41+/puits)] x 100
- Pour compter les plaquettes libérées dans le milieu de culture, mélangez délicatement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur et prélevez 100 μL aux jours 14 ou 15 de la culture.
- Colorer avec 20 μL d’anticorps anti-CD41-FITC humain pendant 20 à 30 min à 4 °C. Mettre en place un tube de contrôle à l’aide de l’anticorps de contrôle d’isotype correspondant.
- Ajouter 150 μL de SB et 50 μL de billes de comptage.
- Pour l’analyse par cytométrie en flux, réglez le FSC et le SSC sur l’échelle logarithmique. Utilisez des plaquettes sanguines humaines normales provenant de plasma riche en plaquettes coloré au CD41-FITC comme décrit à la section 2.4.1 pour régler le déclenchement des plaquettes (Figure 3A).
- Analysez les plaquettes colorées en comptant les billes par cytométrie en flux. Collectez 1 000 événements de comptage de billes à l’aide du diagramme de dispersion FSC par rapport à SSC (Figure 3A). Calculer le nombre de plaquettes en fonction des événements positifs pour CD41-FITC (Figure 3B) à l’aide de la formule :
Plaquettes par μL = [(nombre d’événements positifs pour CD41-FITC)/1 000 billes)] x [(nombre de billes dans 50 μL)/volume de l’échantillon)]
- Pour analyser l’activation plaquettaire, mélangez délicatement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur et prélevez 100 μL aux jours 14 ou 15 de la culture. Ajouter 1 mL de tampon Tyrode (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1,8 mM de CaCl2, 0,2 mM de Na2HPO4, 12 mM de NaHCO3, 5,5 mM de D-glucose, pH de 6,5) et centrifuger à 200 x g pendant 5 min sur les cellules de granules.
- Prélever le surnageant et centrifuger à 800 x g pendant 10 min pour granuler les particules de la taille d’une plaquette.
- Jeter le surnageant et le remettre en suspension dans 100 μL de tampon de Tyrode. Ajouter 20 μL d’anticorps PAC1-FITC et d’adénosine diphosphate (ADP) à une concentration finale de 20 μM. Incuber à température ambiante pendant 20 min. Analyser par cytométrie en flux pour déterminer le pourcentage d’événements positifs au FITC. Utiliser des plaquettes humaines fraîches traitées de la même manière qu’un témoin positif (Figure 3C).
