Système de culture thymique tridimensionnelle pour générer des émigrants thymiques dérivés d’iPSC

Résumé

Source : Vizcardo, R., et al. Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer des émigrants thymiques spécifiques spécifiques de l’antigène tumoral dérivé de cellules souches pluripotentes induites par des souris. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente un protocole permettant de générer des lymphocytes T fonctionnels spécifiques de l’antigène à partir de lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC à l’aide d’un système de culture thymique tridimensionnelle. La co-culture des lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC avec des lobes thymiques fœtaux fœtaux de souris endogènes appauvris en lymphocytes a permis de maturation réussie des lymphocytes T pour former des émigrants thymiques (iTE) dérivés de CD8αβ+ du CMH de classe I+.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. 3D Culture d’organe thymique pour générer iTE

1. Récolter les lobes thymiques fœtaux de souris et déployer des lymphocytes endogènes par traitement à la désoxyguanosine (dGUO).
2. Le 7e jour du traitement dGUO, prendre quatre nouvelles boîtes de 10 cm et remplir chacune de 20 ml de milieu complet (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10 % FBS + 1 x L-alanyl-L-glutamine + 1 x pyruvate de sodium + 1 milieu essentiel minimum avec des acides aminés non essentiels (MEM-NEAA) + 1 x pénicilline-streptomycine + [1:1000] éthanol 2-mercapto).
3. Transférez toutes les membranes de nitrocellulose avec des lobes thymiques dans un plat de 10 cm. Détachez les lobes individuels de la membrane à l’aide d’une pince, ce qui permet de les immerger dans le support. Jetez les membranes. Incuber pendant 1 h à RT.
4. Transférez les lobes thymiques dans une nouvelle boîte de 10 cm avec un milieu complet et incubez pendant 1 h à RT. Répétez cette étape 2 fois de plus.
5. À l’aide d’une pince, fixez les lobes thymiques à la boîte (un à la fois) et, de l’autre main, faites une incision de 100 à 200 μm de profondeur au centre et étendez la moitié du diamètre du lobe pour faciliter la migration des progéniteurs des lymphocytes T dans le lobe.
6. Transvasez les lobes thymiques dans une nouvelle boîte de 10 cm remplie de milieux de différenciation complets (milieux complets + 5 ng/mL d’interleukine-7 de souris (IL-7) + 5 ng/mL de ligand Flt3 de souris (FLT3L) + 5 ng/mL de facteur de cellules souches (SCF)).
7. En option, si vous utilisez des plaques de culture 3D avec des grilles de niveau inférieur et supérieur, remplissez les deux grilles avec du PBS stérile pour éviter l’évaporation et le séchage des gouttes suspendues.
8. Transférez 30 μL de milieu complet contenant un lobe thymique traité au dGuo de l’étape 1.6 dans chaque puits de la plaque de culture 3D.
9. Prélever des cellules de la lignée T non adhérentes (cellules T immatures dérivées d’iPSC) de la co-culture OP9/DLL1 (jours 16-21) et remettre en suspension à 2–5 x 10 cellules de la lignée³ T par milieu de 20 μL.
10. Ajouter 20 μL de suspension de cellules de la lignée T à chaque lobe thymique de la plaque de culture 3D. Incuber toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂.
11. Réglez la pipette P200 à 30 μL et aspirez le milieu après avoir pipeté plusieurs fois dans chaque puits pour éliminer toutes les cellules entourant les lobes thymiques. Jeter le support et ajouter 30 μL de support complet. Répétez cette procédure 5 à 7 fois pour éliminer les lymphocytes T immatures supplémentaires qui ne migrent pas dans les lobes. Changez 25 à 30 μL de milieu par jour par la suite.
12. Confirmer la formation d’un halo d’émigrants thymiques dérivés d’iPSC (iTE) autour des lobes à partir des jours 4 et 5 par microscopie optique.
13. Collectez quotidiennement l’iTE à l’aide d’un support de pipetage sans perturbation des lobes. Changez de support tous les jours et poursuivez la collecte jusqu’à environ 12 jours.
14. Les iTE récoltés sont prêts à être utilisés pour des analyses moléculaires (Figure 1, Figure 2, Figure 3 et Figure 4) ou des expériences de transplantation in vivo.

Résultats

Figure 1 : Immunohistochimie de lobes thymiques ensemencés avec des lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC. En haut : Coloration H&E d’un lobe thymique avec et sans ensemencement de lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC. De la seconde en haut vers le bas : images confocales des lobes sectionnés colorés au DAPI (noyau), CD3 (cellule T), et fusionnent. Barres d’échelle = 10...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-désoxyguanosine	Sigma-Aldrich	Référence 312693-72-4
2-Mercaptoéthanol (1 000x)	Thermo Fisher Scientific	Référence 21985-023
FBS	Gémeaux	100 à 500
Ligand Flt-3	Systèmes de R&D	427-FL
Interleukine-7	Systèmes de R&D	407-ML
Solution d’acides aminés non essentiels MEM	Gibco	11140050
Poudre MEM	Gibco	61100061
Pyruvate de sodium	Thermo Fisher Scientific	Référence 11360-070
Facteur de cellules souches (SCF)	Systèmes de R&D	455-MC
Pénicilline/streptomycine	Thermo Fisher Scientific	Référence 15140-122
Solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	Référence 10010-023
RPMI 1640	Gibco	11875093
Plat de 10 cm	Corning, Inc	353003
Perfecta3D Plaque de chute suspendue	Sigma-Aldrich	HDP1096
forceps	Dumont	Référence 0108-5PO
OP9/N-DLL1	Centre de bioressources Riken	Cat# RCB2927 ; RRID : CVCL_B220
GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher Scientific	Référence 35050-061