Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Expansion des cellules NK à partir des tissus hépatiques (Jour 0), comme le montre la figure 1.
REMARQUE : Le nombre initial de cellules et la viabilité sont fortement corrélés avec le temps écoulé depuis le prélèvement de l’organe et la quantité initiale d’échantillons de tissus. Cependant, si les mouchoirs sont placés dans 30 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et conservés sur de la glace ou au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit, les cellules NK peuvent encore être dilatées avec une pureté et une viabilité élevées jusqu'à 24 heures plus tard.
- Identifier les zones tissulaires viables pour obtenir des lymphocytes à partir de tissus et de coupes à l’aide d’un équipement chirurgical stérile.
- Placez les mouchoirs dans 30 mL de HBSS (sans calcium ni magnésium) et conservez-les sur de la glace jusqu’au moment de vous préparer à l’isolement.
- Coupez le tissu en cubes de <0,5 cm à l’aide de lames de rasoir stériles ou de ciseaux et de pinces à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.
- Préparez une solution de 1x collagénase IV (1 mg/mL) en diluant une dose 10x dans HBSS (10x Collagenase IV : 10 mg/mL ou ~200 U/mL).
- Placez les morceaux de tissu hachés dans les tubes de dissociation des tissus. Remplissez les tubes avec pas plus de 4 g de tissu et plongez les morceaux de tissu dans ~10 mL de 1x collagénase IV.
note: L’utilisation de DNase I n’est pas recommandée car elle peut légèrement diminuer la viabilité et le rendement des NK. Veuillez vous référer à la table des matériaux pour les tubes dissociateurs de tissus spécifiques utilisés.
- Placez les tubes de dissociation tissulaire dans un dissociateur de tissu et mélangez à 37 °C pour bien émincer le tissu.
note: Pour le tissu hépatique, cela peut prendre plus de 30 minutes. Pour des tissus plus friables, environ 15 minutes peuvent suffire. Veuillez vous référer à la table des matériaux pour connaître les tubes de dissociation tissulaire spécifiques et le dissociateur tissulaire utilisé.
- Retirez les tubes de dissociation tissulaire et triturez à travers une passoire à cellules en nylon de 40 μm à l’aide de l’extrémité arrière d’une seringue de 5 ml. Récupérez l’éluant et jetez les gros fragments non digérés.
- Faites tourner l’éluant à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez le surnageant.
- Remettez les pastilles cellulaires en suspension dans de la silice enrobée de polyvinylpyrrolidone (PVP) à 30 % pour éliminer les cellules graisseuses qui contamineraient autrement la fraction lymphocytaire finale.
- Pour préparer 1x silice enrobée de PVP, utilisez une dilution 9:1 de silice enrobée de PVP dans 10x PBS.
note: Reportez-vous au tableau des matériaux pour connaître la silice enduite de PVP utilisée.
- Pour préparer 30 % de silice enrobée de PVP, diluez 1x silice enrobée de PVP avec du PBS/HBSS.
- Faites tourner la pastille cellulaire à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans 9 mL de R-10 media.
note: Reportez-vous à la table des matériaux pour la composition des supports R-10
- Superposez soigneusement la suspension cellulaire sur 4 ml de Ficoll ou de milieu de séparation des lymphocytes pour séparer les lymphocytes des globules rouges et des cellules polymorphonucléaires.
- Séparez les couches en centrifugeant à 400 x g pendant 23 min à température ambiante avec l’accélération et les freins désactivés ou au réglage le plus bas. Décantez soigneusement la couche supérieure et prélevez l’interphase contenant les lymphocytes infiltrant les tissus.
- Rincer les cellules avec 10 ml de milieu et procéder au comptage cellulaire, à la cytométrie en flux, à l’aliquotage et à la congélation des cellules, ou au protocole d’expansion primaire des NK.
2. Expansion primaire des cellules NK à partir de PBMC (ou CB ou tissus d’organe) (Jour 0), comme le montre la figure 2.
- Décongeler les PBMC congelés et les cellules nourricières congelées et irradiées dans un bain d’eau à 37 °C.
- Laver séparément le PBMC et 100 cellules irradiées aux rayons gamma (irradiés par Gy) de 221 mIL-21 par centrifugation à 400 x g pendant 5 min avec 10 mL de milieu R-10.
- Enregistrez 1 x 106 cellules de PBMC pour la cytométrie en flux.
note: La pureté initiale de la cellule NK est un facteur important dans le calcul du taux d’expansion des cellules NK.
- Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu R-10. Comptez les cellules à l’aide de Trypan Blue.
- Mélangez 5 x 106 cellules de PBMC avec 10 x 106 cellules de 100 cellules de 221 mIL-21 irradiées au Gy dans une plaque spéciale à 6 puits (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter 30 mL de milieu R-10 complété par de l’IL-2 humaine (200 U/mL) et de l’IL-15 humaine (5 ng/mL) (voir le tableau des matières).
- Incuber la plaque spéciale à 6 puits à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Remplacez le milieu par un milieu R-10 complété par de l’IL-2 humaine (200 U/mL) et de l’IL-15 humaine (5 ng/mL) pour maintenir les cellules NK tous les 3-4 jours.
note: Maintenir moins de 20 x 106 cellules par puits pour une expansion supplémentaire à chaque changement de milieu. Pour une meilleure viabilité, assurez-vous que le nombre total de cellules dans chaque puits ne dépasse pas 100 x 106 cellules.
- Enregistrez le nombre total de cellules, la viabilité et effectuez une cytométrie en flux tous les 3-4 jours pour calculer le taux d’expansion des cellules NK.
