Expansion ex vivo de cellules tueuses naturelles à partir de cellules mononucléées du sang périphérique

Résumé

Source : Ma, M., et al. Méthode d’expansion cellulaire Natural Killer (NK) et CAR-NK utilisant une lignée de cellules B modifiée par Membrane Bound-IL-21. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo présente une technique d’expansion de cellules tueuses naturelles (NK) directement à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à l’aide d’une lignée cellulaire nourricière. Les PBMC sont co-cultivées avec des cellules nourricières lymphoblastoïdes génétiquement modifiées exprimant l’interleukine-21 liée à la membrane (mIL-21), et la culture est complétée par les cytokines interleukine-2 (IL-2) et interleukine-15 (IL-15). Ensemble, ce cocktail de ligands conduit à l’expansion prolongée des cellules NK de grande pureté.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Expansion des cellules NK à partir des tissus hépatiques (Jour 0), comme le montre la figure 1.

REMARQUE : Le nombre initial de cellules et la viabilité sont fortement corrélés avec le temps écoulé depuis le prélèvement de l’organe et la quantité initiale d’échantillons de tissus. Cependant, si les mouchoirs sont placés dans 30 ml d....

Résultats

Figure 1 : Schéma de l’expansion des cellules NK à partir d’échantillons d’organes humains solides. En bref, les échantillons de foie humain obtenus sont hachés en petits cubes pour une digestion mécanique. Les cellules dissociées sont ensuite isolées à l’aide de silice enrobée de PVP et d’un milieu de séparation des lymphocytes. De plus, les cellules NK sont développées à l’aide du protocole .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque G-REX à 6 puits	Wilson Wolf	Référence 80240M	Pour l’expansion des cellules NK
Fragment de chèvre AffiniPure F(ab')2 conjugué à l'AF647 (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Tél. : 109-606-088	Pour la cytométrie en flux
Collagénase IV	sigma	C4-22-1G	Pour l’isolation des TIL
Milieux cryoconservés	Corning	35-010-CV	90 %
Ingrédient : Sérum de veau fœtal (FBS)
Milieux cryoconservés	sigma	Réf. D2050	10 %
Ingrédient : Diméthylsulfoxyde (DMSO)
Tubes C gentleMACS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-093-237	Pour l’isolation des TIL
douxMACS Octo	Miltenyi Biotec	citer	Pour l’isolation des TIL
Solution saline équilibrée de Hank's (HBSS - sans calcium ni magnésium)	ThermoFisher	14170120	Pour l’isolation des TIL
IL-15 humaine	Peprotech	200-15	Pour l’expansion des cellules NK
IL-2 humaine	Peprotech	Référence 200-02	Pour l’expansion des cellules NK
Cellules nourricières irradiées de 221 mIL21	Généré dans le laboratoire du Dr Dongfang Liu		Congelé dans un milieu cryoconservé
Milieu de séparation des lymphocytes	Corning	25-072-CV	Pour l’isolation des TIL
Clone CD3 anti-humain PE HIT3a	Biolégende	300308	Pour la cytométrie en flux
PE/Cy7 clone CD56 anti-humain (NCAM) 5.1H11	BioLégende	362509	Pour la cytométrie en flux
Percoll	GE Soins de santé	17089101	Pour l’isolation des TIL
Cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)	Centre de transfusion sanguine de New York		Isolé à partir du plasma de donneurs sains, congelé dans un milieu cryoconservé
Média R-10	VWR	45000 à 404
Ingrédients : RPMI 1640
Média R-10	VWR	Réf. 45000-304	1 %
Ingrédient : L-glutamine
Média R-10	VWR	45000-652	1 %
Ingrédient : Pénicilline Streptomycine
Média R-10	Corning	35-010-CV	10 %
Ingrédient : Sérum de veau fœtal (FBS)
Bleu trypan	Corning	25-900-CL	Pour le comptage cellulaire