Une In vitro Méthode pour préparer fonctionnelle des récepteurs des glucocorticoïdes (GR) • hsp90 complexes protéiques à partir des protéines purifiées et de lysats cellulaires est décrite. La méthode utilise immunoadsorption de recombinaison GR suivie par le sel de décapage et de reconstitution des protéines complexes. L'importance des cofacteurs et les conditions de tampon sont discutées, tout comme les applications de méthodes possibles.
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Article de méthode
Reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines Hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand
Dans cet article
Résumé
Résumé
Hsp90 est une protéine chaperonne essentiel et très abondante moléculaire qui a été trouvé pour régler plus de 150 eucaryotes protéines de signalisation, y compris les facteurs de transcription (par exemple les récepteurs nucléaires, p53) et les protéines kinases (par exemple, Src, Raf, protéine Akt) impliqués dans le cycle cellulaire, tumorigenèse, l'apoptose, la signalisation et les multiples voies de 1,2 eucaryotes. Parmi ces nombreuses «client» pour les protéines HSP90, l'assemblage des récepteurs stéroïdiens • hsp90 complexes est mieux définis (figure 1). Nous présentons ici un récepteur adapté aux glucocorticoïdes (GR) de dosage immuno-précipitation et in vitro GR • La méthode de reconstitution hsp90 qui peut être facilement utilisé pour sonder eucaryotes hsp90 activité fonctionnelle, hsp90 médiée ligand du récepteur de liaison des stéroïdes, et moléculaire exigences cofacteur chaperon. Par exemple, ce test peut être utilisé pour tester HSP90 exigences cofacteur et les effets de l'ajout de composés exogènes au processus de reconstitution.
Le GR a été un système particulièrement utile pour étudier parce hsp90 le récepteur doit être lié à hsp90 d'avoir une liaison d'un ligand ouverte fissure qui est accessible à trois stéroïdes. Endogènes, GR unliganded est présent dans le cytoplasme des cellules de mammifères non covalente lié à hsp90. Comme l'a constaté dans le GR endogène • hsp90 hétérocomplexe, la fixation du ligand GR fente est ouverte et capable de liaison des stéroïdes. Si hsp90 dissocie du GR ou si sa fonction est inhibée, le récepteur est incapable de se lier de stéroïdes et nécessite la reconstitution de la GR • hsp90 hétérocomplexe avant l'activité de liaison des stéroïdes est restaurée 4. GR peut être immunoprécipité du cytosol des cellules en utilisant un anticorps monoclonal, et des protéines telles que hsp90 complexé à la GR peut être analysée par western blot. Steroid activité de liaison du GR immunoprécipité peut être déterminée par incubation de la immunopellet avec [3 H] stéroïdes.
Des expériences antérieures ont montré hsp90 médiée par l'ouverture de la liaison d'un ligand GR fissure nécessite hsp70, un chaperon moléculaire seconde également essentielle pour la viabilité des cellules eucaryotes. Activité biochimique de hsp90 et hsp70 sont catalysées par des co-chaperon Hop protéines, HSP40, et p23 5. Un chaperon machines multiprotéiques contenant hsp90, hsp70, Hop, et HSP40 endogène sont présents dans le cytoplasme des cellules eucaryotes, et lysat de réticulocytes fournit un chaperon riche source de protéines 6.
Dans la méthode présentée, GR est immunoadsorbed du cytosol des cellules et dépouillé de la machinerie chaperon hsp90/hsp70 endogènes en utilisant les conditions du sel doux. Le GR sel extrait est ensuite incubée avec réticulocytes lysat, l'ATP, et K +, ce qui aboutit à la reconstitution de la GR • hsp90 hétérocomplexe et la réactivation de l'activité de liaison des stéroïdes 7. Cette méthode peut être utilisée pour tester les effets de cofacteurs différents chaperon, de nouvelles protéines, et les inhibiteurs de HSP90 expérimentale ou GR afin de déterminer leur importance fonctionnelle sur hsp90 médiée stéroïdes 8-11 contraignant.
Protocole
1. Préparation du cytosol des cellules contenant GR fonctionnelle
- Note technique: Tous les tampons doivent être réfrigérés et chaque étape de ce protocole, y compris les centrifugations et d'incubation, doit être effectuée sur la glace ou à 4 ° C, sauf indication contraire. La basse température est essentielle pour prévenir la dégradation des complexes GR et des protéines.
- En utilisant une centrifugeuse réfrigérée, obtenir un ~ 1-5 ml culot de cellules qui exprime une forte concentration de GR fonctionnelle. Exemples de sources de cellules riches en GR comprennent de fibroblastes de souris L929, qui expriment une forte concentration de GR endogèn....
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Discussion
L'essai décrit ci-dessus peut être adapté pour tester une multitude de conditions affectant les actions de la machinerie chaperon chaperon hsp90/hsp70-based ainsi que GR contraignante stéroïdes. Il s'agit d'une modification des méthodes précédemment rapporté 4,8,9,17 et est conçu pour tirer profit des progrès récents dans la technologie d'électrophorèse et être accessible à une communauté plus large de recherche. Cofacteurs supplémentaires ou des protéines d'intérêt peut être ajouté à la G.......
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Déclarations de divulgation
Sélectionnez réactifs d'électrophorèse et des logiciels d'analyse d'images ont été fournies par Bio-Rad.
Remerciements
Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé accorde GM086822, Hope Institut de cardiologie de sciences fondamentales prix, et le MJ Murdock Charitable Trust Collège programme de recherche scientifique. Sélectionnez réactifs d'électrophorèse et des logiciels d'analyse d'images ont été généreusement offerts par Bio-Rad.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Cellules d'insectes Sf9 | Invitrogen | d'expression baculovirus recombinant de souris de GR | |
| L929 | ATCC | LCR-2173 | endogènes de souris GR préparation cytosol (alternative à l'expression de baculovirus) |
| FiGR hybridomes | ATCC | LCR-2173 | pour la préparation de l'ascite contenant des anticorps anti-GR anticorps monoclonal (alternative à purifier BuGR2 anticorps) |
| Inhibiteur de la protéase complète-Mini, de l'EDTA-libres | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protéine A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| lysat de réticulocytes de lapin | Hectares vert (Oregon, WI) | riche source de machines chaperon endogènes hsp90/hsp70 | |
| créatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | pour l'ATP-régénérant du système |
| phosphocréatine | Sigma-Aldrich | P7936 | pour l'ATP-régénérant du système |
| d'anticorps de souris anti-GR monoclonaux (BuGR2) | Pierce / Thermo Scientific | MA1-510 | utilisés pour le GR immunoadsorption et des anticorps primaires dans le western blot |
| d'anticorps de souris anti-hsp90 monoclonaux (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | utilisé comme anticorps primaire en western blot |
| anticorps de souris anti-Hsp70 monoclonaux (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | utilisé comme anticorps primaire en western blot |
| IgG de sérum de souris | Sigma-Aldrich | 038K7690 | utilisé comme anticorps non immunisées pour le contrôle négatif de immunoadsorption |
| IgG anti-souris-peroxydase | Sigma-Aldrich | A4416 | utilisé comme anticorps secondaire dans l'ouest de buvard |
| Système d'électrophorèse microfluidique Experion | Bio-Rad | 7007001 | alternative à la traditionnelle SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7 - 3 H] dexaméthasone | PerkinElmer | NET1192001MC | suivez les précautions de sécurité |
Références
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M.
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Réimpressions et autorisations
