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1. Préparation des lames pour faire adhérer les cellules Raji
- Ajouter 150 μL de fibronectine (100 μg/mL) par puits dans une lame de chambre à 8 micropuits (lame de chambre à fond en plastique) et l’incuber pendant 30 min à 1 h à 37 °C. Ce substrat d’adhésion permettra la liaison des cellules Raji au fond du puits (étape 2), la formation de conjugués vivants avec les cellules Jurkat (étape 4) et la capture par microscopie time-lapse (étape 6), et est également compatible par la suite avec la fixation facultative du paraformaldéhyde (PFA).
REMARQUE : Pour la fixation à l’acétone, utilisez des lames de chambre à fond de verre et de la poly-L-lysine (20 μg / mL) au lieu de la fibronectine, car l’acétone dissout le plastique. La lame de chambre à 8 micropuits (1 cm,2 puits, volume maximal de 300 μL) ou l’équivalent est un format souple et approprié.
- Aspirez la fibronectine à l’aide d’une pipette automatique de 200 μL et lavez chaque puits avec 200 μL de PBS pendant 2 minutes en secouant doucement. Répétez ce lavage une fois de plus. La lame de chambre peut être stockée à ce stade avec du PBS pendant 1 à 2 semaines à 4 °C.
2. Adhérence des cellules de Raji aux lames de chambre et marquage de la 7-amino-4-chlorométhylcoumarine (CMAC)
- Transvaser 10 mL d’une pré-culture confluente (1-2 x 106 cellules/mL) de cellules Raji dans un tube à fond en V de 15 mL. Bien mélanger et utiliser 10 μL pour compter les cellules sur la chambre de Neubauer ou l’équivalent.
- Centrifugez les cellules restantes à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez et jetez le surnageant.
- Remettre doucement la pastille cellulaire en suspension dans un milieu de culture complet chaud (RPMI 1640 complété par 10 % de FCS, 2 mM de glutamine, 10 mM d’HEPES, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à une concentration de 10à 6 cellules/mL. Utilisez l’équation donnée ci-dessous :
([ ]initial x Vinitial = [ ]final x Vfinal), où [ ]initial représente la concentration initiale de la cellule, Vinitial = volume initial de la suspension cellulaire, [ ]final = concentration finale de la cellule, Vfinal = volume final de la suspension cellulaire.
REMARQUE : En fonction de la concentration cellulaire de la culture initiale, il est possible de collecter plus de cellules que nécessaire, mais il est important de maintenir les cellules restantes en culture (37 °C) jusqu’à la fin de l’expérience afin d’éviter des problèmes potentiels (voir étape 2.6).
- Marquez les cellules Raji pour permettre leur identification lors de la formation du conjugué synaptique. Dans cette expérience, le marquage de la 7-amino-4-chlorométhylcoumarine (CMAC) est effectué à l’étape 2.4.2.
- Transférez le nombre requis de cellules Raji dans le milieu de culture dans un tube de 2 mL. Pour les lames de la chambre à 8 micropuits, un total de 1,6 mL de suspension cellulaire est nécessaire (200 μL par puits).
- Ajoutez du CMAC à une concentration finale de 10 μM. Gardez les cellules dans l’obscurité en recouvrant le tube d’une feuille d’aluminium car le CMAC est sensible à la lumière. 200 μL contenant 2 x 105 cellules Raji sont nécessaires par puits de 1 cm2. Ainsi, si 8 puits doivent être préparés, 1,6 x 10cellules 6 Raji sont nécessaires.
REMARQUE : Le marquage des cellules Raji avec le traqueur de cellules bleu (CMAC, excitation UV et émission bleue) les distingue des cellules Th lorsque les conjugués synaptiques sont formés. Ce colorant est compatible avec les fixateurs de PFA et d’acétone et permet d’autres procédures d’immunofluorescence. Essayez d’éviter l’exposition à la lumière. Le marquage des cellules Raji dans un pool avec CMAC, suivi d’une remise en suspension avant l’adhésion des cellules Raji aux lames de chambre recouvertes de fibronectine, assure le marquage homogène des cellules Raji avec CMAC entre différents puits.
- Remettre en suspension les cellules colorées au CMAC et, après l’aspiration du PBS dans la lame de chambre de l’étape 1.2, transférer 200 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits des lames de chambre recouvertes de fibronectine préparées aux étapes 1.1-1.2. Incuber la lame de chambre à 37 °C, 5 % CO2 pendant 30 min-1 h.
REMARQUE : L’adhérence et l’étiquetage CMAC se produiront simultanément à cette étape, ce qui permet de gagner du temps. Veuillez noter que les cellules Raji se sédimentent rapidement et qu’il faut faire attention à maintenir une concentration homogène dans la suspension cellulaire avant l’ensemencement. Il n’est pas nécessaire de laver le CMAC à ce stade par centrifugation puisque le lavage du CMAC se fera plus facilement à l’étape 2.7 (lorsque les cellules Raji marquées ont déjà adhéré aux lames de la chambre). Étant donné que le CMAC est présent dans la suspension cellulaire en grand excès, le fond de fluorescence bleu est trop élevé pour distinguer les cellules colorées en bleu. Vérifiez la fluorescence CMAC de la cellule à l’étape 2.7 après le lavage du CMAC.
- Assurez-vous que les cellules Raji adhèrent au fond des puits en secouant doucement les lames de la chambre sur le microscope. Assurez-vous que les cellules présentent des espaces entre elles et qu’elles ne sont pas confluentes (Figure 1, panneau du milieu). 50 à 60 % de la confluence cellulaire est appropriée.
- Si la plupart des cellules adhèrent efficacement à la lame de la chambre et qu’aucun espace cellulaire n’est observé, lavez chaque puits avec un milieu complet chaud et remettez le milieu en suspension avec une pipette automatique de 200 μL pour détacher l’excédent de cellule. Vérifiez la confluence après chaque étape de remise en suspension.
- Si les cellules n’adhèrent pas, répétez l’étape d’adhésion à nouveau et augmentez le temps d’adhésion et/ou le nombre de cellules.
REMARQUE : Il est possible de s’arrêter ici, d’incuber la lame de chambre à 37 °C, 5 % de CO2 pendant la nuit (O/N), et de continuer avec le protocole le lendemain. Veuillez confirmer le lendemain que les cellules Raji restent adhérentes et marquées CMAC en utilisant la microscopie à fluorescence.
- Lavez à nouveau soigneusement chaque puits avec du RPMI chaud complété pour éliminer l’excès de CMAC et vérifiez l’émission bleue avec le microscope à fluorescence (Figure 1).
REMARQUE : Pour éviter l’utilisation d’huile d’immersion (collante et visqueuse) et d’objectifs à huile à grande ouverture numérique, des objectifs à très longue distance (c’est-à-dire 20x ou 40x) peuvent être utilisés pour vérifier rapidement l’étiquetage CMAC à l’aide du microscope à fluorescence.
3. Pouls de CMAC — Cellules de Raji marquées avec entérotoxine staphylococcique E
- Ajouter l’entérotoxine staphylococcique E (SEE, 1 μg/mL) dans chaque puits. Le SEE peut être facilement dilué dans un milieu de culture cellulaire (solution de travail à 100 μg/mL) à partir des stocks congelés SEE (1 mg/mL dans le PBS). Utilisez 2 μL de la solution de travail 100x par micropuits de 200 μL.
ATTENTION : Utilisez des gants pour cette étape et jetez l’embout usagé dans la boîte de risque biologique.
- Incuber la lame de chambre à 37 °C, 5 % CO2 pendant au moins 30 min. L’effet SEE dure au moins 3-4 h.
REMARQUE : SEE peut être ajouté aux puits à différents moments si nécessaire si des configurations distinctes sont prévues (étape 5) et/ou en fonction du point de début des expériences finales (étape 6).
4. Préparation des cellules Jurkat
- Utilisez une culture de cellules Jurkat préalablement cultivée (1-2 x 106 cellules/mL) pour cette expérience. Utiliser des cellules d’un flacon de culture standard ou d’une transfection précédente selon les protocoles d’électroporation standard, comme décrit précédemment. La transfection des cellules Jurkat permettra de visualiser en accéléré le trafic des granules sécrétoires dans les cellules vivantes. Par exemple, lorsque GFP-CD63 (un marqueur de MVB) est exprimé, le mouvement des vésicules décorées de GFP-CD63 peut être enregistré.
- Observez les cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Si un excès de cellules mortes (>20-30 %) est observé, effectuer une centrifugation par gradient de densité de Ficoll en utilisant les protocoles standard, afin d’éliminer l’excès de cellules mortes (les cellules mortes présentent une densité plus élevée que les cellules vivantes) avant l’utilisation (voir Discussion).
- Transférez les cellules dans un tube de 15 mL, à fond en V, et utilisez 10 μL pour le comptage à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifugez les cellules restantes comme décrit à l’étape 2.2. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension à la même concentration que les cellules Raji (1 x 106/mL) à l’aide d’un milieu de culture frais et chaud. Suivez les étapes 2.2 et 2.3.
- Maintenir les cellules Jurkat en culture (37 °C, 5 % CO2) en attendant l’étape 4.
REMARQUE : Dans la deuxième option (transfection), le nombre de cellules vivantes sera beaucoup plus faible que dans la première. Ainsi, envisagez d’utiliser un volume de culture cellulaire de départ plus élevé afin d’avoir suffisamment de cellules pour l’expérience. De 10 x 106 cellules Jurkat par cuvette d’électroporation et transfection, seules 2-4 x 106 cellules Jurkat survivront après 48 h de transfection et certaines de ces cellules seront perdues lors de l’étape de Ficoll. Ainsi, une cuvette d’électroporation est généralement suffisante pour défier les cellules Raji pulsées SEE collées à partir de 8 micropuits (1,6 x 106 cellules Jurkat transfectées nécessaires).
5. Co-ensemencement des cellules Raji et Jurkat
- Sortez de l’incubateur à partir de l’étape 3.2 les lames de chambre contenant les cellules de Raji adhérentes marquées au CMAC, pulsées par SEE, de l’incubateur. Il n’est pas nécessaire de laver le CMAC à ce stade, car cela a déjà été fait à l’étape 2.7.
- Aspirez soigneusement le milieu de culture de chaque puits, un par un, d’un coin du puits à l’aide d’une pipette automatique de 200 μL. Ne laissez pas le milieu dans le puits se dessécher complètement.
- Remplacer immédiatement le milieu par 200 μL de cellules Jurkat remises en suspension dans le milieu de culture cellulaire (1 x 106/mL) préparé à l’étape 4.5. Si une imagerie time-lapse est effectuée, passez à l’étape 6 immédiatement après cette étape, car les cellules Jurkat ont tendance à se sédimenter et à former des conjugués synaptiques très rapidement. Pour plus de commodité, les micropuits contenant des cellules Raji adhérentes à impulsions SEE qui ne reçoivent pas d’ensemencement avec des cellules Jurkat à ce stade doivent être maintenus avec un milieu de culture cellulaire jusqu’à ce qu’ils soient ensuite soumis à un test de provocation avec des cellules Jurkat. Cela permettra de relever de manière flexible les défis ultérieurs avec les cellules Jurkat pour des approches expérimentales supplémentaires en accéléré ou en cinétique inverse
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- Si un time-lapse doit être effectué, passez rapidement à l’étape 6. Cela implique la co-culture pendant 1 à 2 h sur l’incubateur de la platine du microscope ou l’équivalent à 37 °C, 5 % de CO2 pour permettre la formation du conjugué synaptique et l’acquisition simultanée d’images. Si une analyse des points finaux, mais pas de time-lapse, est prévue, vérifiez la formation des conjugués après la période de co-culture à l’aide du microscope (comme sur la figure 1) avant de fixer les cellules.
6. Imagerie en accéléré des conjugués synaptiques émergents
- Préparez le microscope et la chambre d’incubation avant l’imagerie. À titre d’exemple, les paramètres détaillés de la microscopie sont illustrés à la figure 2.
REMARQUE : Si une expérience en accéléré est prévue, tous les réglages et compléments du microscope (chambre de culture cellulaire ambiante, etc.) doivent être préparés avant d’ajouter la suspension Jurkat à la lame de la chambre avec des cellules Raji collées. Les étapes suivantes sont décrites pour un microscope commercial (Table des matériaux). Cependant, tout microscope à fluorescence inversée équipé d’un incubateur de culture cellulaire peut être utilisé.
- Utilisez un microscope avec une immersion dans l’huile 60x et une ouverture numérique élevée pour imager le trafic polarisé.
- Assurez-vous que le système de mise au point automatique est activé et ajustez le décalage pour faire la mise au point des cellules Raji liées à la surface inférieure. Veuillez vous référer à la figure 1.
- Après l’ajout de Jurkat à chaque puits contenant les cellules de Raji collées à l’étape 5.3, localisez rapidement la lame de la chambre à micropuits sur l’incubateur de platine de microscope préchauffé (1-2 h) (c’est-à-dire OKOlab) et sélectionnez quelques positions XY avec le microscope, domaines dans lesquels il est probable d’enregistrer une formation de SI émergente faite, par exemple, par une cellule transfectée par Jurkat tombant dans le foyer du microscope.
- Utilisez un incubateur de platine de microscope préchauffé car il a été observé qu’une platine stabilisée en température maintient des positions X, Y, Z stables. Les critères pour un champ XY pratique sont : des cellules Raji bien focalisées et non confluentes (c’est-à-dire affichant des écarts entre les cellules) et la présence de cellules Jurkat transfectées (cela peut être vérifié en combinant la transmittance et les canaux UV ou GFP). Les cellules Jurkat se sédimentent très rapidement (quelques minutes) sur la lame de la chambre, et les chances d’imager les synapses émergentes diminuent avec le temps (Figure 1). Il est possible soit de terminer l’expérience après le laps de temps défini, soit de passer à l’étape 7 et de fixer les conjugués pour l’immunofluorescence et les analyses ultérieures.
REMARQUE : Il est possible de sélectionner jusqu’à 16 champs de microscope différents à partir d’un maximum de 4 micropuits différents pour une acquisition simultanée en accéléré à plusieurs puits avec la résolution temporelle appropriée (1 à 2 min par image). La limitation repose à la fois sur le nombre et l’intensité (affectant l’exposition de la caméra) des divers fluorochromes à imager (en fonction du nombre de protéines fluorescentes exprimées, à l’exception du CMAC). Une façon d’augmenter la fréquence d’images est d’enregistrer pour le canal CMAC dans seulement une des « n » images temporelles pour la GFP (c’est-à-dire n = 8, comme le montre la figure 2) puisque les cellules Raji sont collées au fond du puits et ne se déplacent pas facilement comme les cellules Jurkat. De plus, cela profite à la viabilité cellulaire, car une exposition fréquente à la lumière UV peut endommager les cellules. Essayez d’ajuster la fréquence d’images à 1 image toutes les 1 minute ou moins (c’est-à-dire 20 s par image, Figure 2), car la polarisation de MVB prend quelques minutes à quelques heures. Un microscope équipé d’une tourelle d’épifluorescence motorisée et de filtres de fluorescence passe-bande appropriés ou équivalents est nécessaire pour effectuer cette capture multicanaux.
