Reconnaissance de marqueurs CD de cellules tueuses induites par des cytokines humaines par cytométrie en flux

Résumé

Source : Hsiao, C. H., et al. Isolement et expansion de lymphocytes T tueurs induits par des cytokines cytotoxiques pour le traitement du cancer. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique basée sur la cytométrie en flux pour déterminer la proportion de cellules T tueuses induites par des cytokines, des cellules CIK, développées à partir d’une culture de cellules mononucléées du sang périphérique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Induction et expansion CIK

1. Le jour 0, cultiver les PBMC (1 x 10⁶) dans un milieu basal frais contenant 1 000 UI/mL d’IFN-γ pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Le jour 1, rafraîchir le milieu avec un milieu basal frais contenant 50 ng/mL d’anticorps anti-CD3, 1 ng/mL d’IL-1α et 1 000 U/mL d’IL-2 alliée 2. Rafraîchissez le support tous les 3 jours.
3. Le jour 7, rafraîchir le milieu avec un milieu basal frais contenant 1 000 U/mL de rh IL-2. Rafraîchissez le milieu tous les 3 jours jusqu’à la fin de l’expansion cellulaire (jour 14).

2. Immunophénotypage pour l’évaluation des cellules CIK

1. Laver les cellules CIK avec 10 mL de PBS stérile. Centrifuger pendant 10 min à 300 x g et 18−20 °C, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 10 mL de PBS. Comptez le nombre de cellules et testez la viabilité de la cellule à l’aide du test d’exclusion du bleu de trypan.
2. Aliquote les cellules CIK dans six tubes stériles de 1,5 mL à une densité de ~5–10 x 10⁵ cellules/mL de PBS. Étiqueter et traiter comme suit : Tube 1, blanc (sans anticorps) ; Tube 2, ajouter 20 μL d’isotype IgG1-FITC ; Tube 3, ajouter 20 μL d’anticorps monoclonaux isotypiques IgG1-APC ; Tube 4, ajouter 20 μL de CD3-FITC ; Tube 5, ajouter 20 μL d’anticorps monoclonaux CD56-APC ; et le tube 6, ajouter 20 μL de CD3-FITC et 20 μL d’anticorps monoclonaux CD56-APC.
3. Mélangez délicatement les cellules CIK avec les anticorps en les pipetant doucement de haut en bas au moins 3 fois avec une pipette stérile de 1 ml, puis incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
4. Centrifugez les tubes pendant 10 min à 300 x g et 18−20 °C. Aspirez le surnageant et suspendez la pastille cellulaire une fois avec 1 mL de PBS. Pipetez-les doucement de haut en bas au moins 3 fois avec une pipette stérile de 1 ml.
5. Répétez l’étape 2.4.
6. Laissez les tubes dans l’obscurité avant l’analyse cytométrique en flux.

3. Reconnaissance des marqueurs de CD

1. Transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile à fond rond en polystyrène de 5 ml avec un capuchon de crépine cellulaire (maille de 100 μm) en pipetant doucement à travers le bouchon. Mettez les tubes sur le carrousel dans l’ordre.
2. Ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et créez un dossier expérimental. Cliquez sur le bouton Nouvel échantillon pour ajouter un échantillon et un tube à l’expérience et nommez les tubes comme suit : Tube 1, Vierge ; Tube 2, Isotype IgG1-CD3; Tube 3, Isotype IgG1-CD56; Tube 4, CD3 ; Tube 5, CD56 ; Tube 6, CD3CD56.
3. Créez un système de contrôle de dispersion pour les populations de cellules CIK (Figure 1A).
   1. Sélectionnez Tube 1 (Blank) et cliquez sur le bouton Dot Plot pour créer un graphique FSC-A/SSC-A. Tracez une porte rectangulaire sur l’ensemble de la population cellulaire avec un seuil FSC-A >5 x 10⁴ pour exclure les débris cellulaires.
   2. Sélectionnez le paramètre SSC-A/SSC-H pour le nouveau graphique à points et tracez une porte polygonale autour de toutes les cellules individuelles. Sélectionnez les paramètres Count/FITC (CD3) et Count/APC (CD56) pour le nouveau tracé d’histogramme, respectivement. Sélectionnez le paramètre FITC (CD3)/APC (CD56) pour le nouveau graphique à points et dessinez une porte à quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations.
   3. Enregistrez les données de 20 000 cellules individuelles dans chaque échantillon. Cliquez sur le bouton Charger l’échantillon pour analyser d’abord l’échantillon de contrôle vierge. Identifiez l’ensemble de la population de cellules CIK à l’aide des paramètres des canaux CD56 et CD3.
4. Répéter l’étape 3.3 pour l’examen de tous les échantillons.
5. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques de l’échantillon individuel pour analyser les populations de cellules CIK et réimprimez-les dans des fichiers d’analyse.

Résultats

Figure 1 : Proportion de lymphocytes T CD3⁺CD56⁺ provenant d’un échantillon représentatif de PBMC.(A) Les lymphocytes ont été reconnus par leur taille et leur granularité spécifiques. Population unicellulaire sélectionnée pour l’analyse par cytométrie en flux. (B) L’analyse statistique de l’efficacité de l’expansion de CIK chez trois donneurs sains a été réalisée à l’aid...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-CD56 humain de souris APC	Bd	555518	Réf. B159
Souris APC IgG1, contrôle de l’isotype κ	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Cytomètre en flux	Bd	338962	SN : R33896202856
Aigle modifié de Dulbecco moyen/F12	HyClone	SH30023.02	Milieu basal pour la culture cellulaire OC-3
Sérum fœtal bovin	HyClone	SH30084.03	Pour la culture cellulaire K562 et OC-3. Le support complet contient 10 % de FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Sciences de la vie	Référence 71101700-EK	Solution de gradient de densité
FITC Souris Anticorps anti-CD3 humain	Bd	555332	UUCHT1
FITC souris IgG1, contrôle de l’isotype κ	Bd	555748	MOPC-21
Anticorps monoclonaux anti-CD3 humains	Takara	T210	OKT3 Ajouter 2,5 mL de bouillon (1 mg/1 mL) à 50 mL de milieu à induction. Stock de stockage à -80 °C
RPMI1640 moyen	Gibco	Référence 11875-085	Milieu basal pour la culture cellulaire K562. Stock de stockage à 4 °C