Dosage pour l’identification de la sécrétion d’interféron gamma dans les organes lymphoïdes murins

Résumé

Source : Mazet, J. M., et al. Imagerie de la production in situ d’interféron gamma dans la rate de souris suite à une infection à Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une méthode d’imagerie permettant de visualiser in situ la sécrétion d’interféron-gamma (IFN-γ) dans la rate de souris. Suite à une infection bactérienne et à l’induction de l’accumulation d’IFN-γ à l’intérieur des lymphocytes T et des cellules tueuses naturelles, la rate est prélevée sur la souris. Lors de l’obtention de coupes de tissus, une immunocoloration est effectuée pour visualiser l’IFN-γ à l’intérieur des cellules.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Transfert adoptif de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène chez la souris

1. Isolez les lymphocytes T CD8⁺ (OTI) spécifiques de l’ovalbumine (OVA) exprimant la protéine fluorescente verte (OTI-GFP) ou la protéine fluorescente rouge (OTI-RFP) à partir de la suspension ganglionnaire de souris transgéniques à récepteur des lymphocytes T à l’aide d’une trousse d’isolement de lymphocytes T CD8⁺ de souris conformément aux instructions du fabricant. Préparez la suspension cellulaire en écrasant les ganglions lymphatiques à l’aide d’un piston de seringue, comme décrit précédemment.
2. Transférez des cellules OTI-GFP ou OTI-RFP (3 x 10⁶ cellules) chez des souris de type sauvage C57BL/6 par injection intraveineuse, comme décrit par Cahalan et al. Utilisez des souris âgées de 6 à 12 semaines.
   note: Cette étape est facultative et n’est requise que pour le suivi des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de l’antigène.

2. Infection à Listeria monocytogenes

1. Développer L. monocytogenes génétiquement modifié pour exprimer les OVULES (LM-OVA) jusqu’à une phase exponentielle de croissance dans une perfusion cardiaque en bouillon à 37 °C sous une légère agitation jusqu’à ce que la DO 600 atteigne 0,08–0,1, comme décrit précédemment.
2. Injecter 100 μL (volume maximal = 200 μL) de 0,1 à 0,5 LD50 LM-OVA dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par injection intraveineuse à l’aide d’une seringue d’insuline de 29 G, chez des souris de type sauvage C57BL/6 portant des cellules OTI-GFP ou OTI-RFP lorsque cela est indiqué.
   note: Dans nos mains, 0,1 x LD50 LM-OVA correspond à 2 x 10⁴ unités formant colonies (UFC). L. monocytogenes génétiquement modifié pour exprimer l’OVA est utilisé pour activer les lymphocytes T CD8⁺ OTI précédemment transférés, mais d’autres souches de L. monocytogenes peuvent être utilisées.

3. Traitement par la Brefeldine A (BFA) pour bloquer la sécrétion de cytokines

1. Injecter 250 μg de BFA dans 200 μL de PBS par voie intrapéritonéale pendant 6 h avant le sacrifice de souris à l’aide d’une seringue à insuline de 29 G.
   note: Le BFA lyophilisé est d’abord remis en suspension dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour préparer une concentration de 25 mg/mL. Le BFA est ensuite dilué dans du PBS à température ambiante (RT) pour éviter la cristallisation avant l’injection. L’inhibition de la sécrétion de cytokines induit l’accumulation d’IFNγ dans les cellules. Ceci est crucial pour la détection des cytokines.

4. Récolte de la rate

1. Euthanasier les souris en utilisant des concentrations croissantes de_CO2 suivies d’une luxation cervicale.
   note: Suivez les directives de l’établissement local pour l’euthanasie sans cruauté des souris.
2. Nettoyez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % et faites une incision avec des ciseaux pour faire une coupe de 1 à 2 cm à travers la peau sur le flanc gauche de la souris, où se trouve la rate. Faites soigneusement une incision dans le péritoine pour exposer la rate et retirez-la avec une pince à épiler. Récoltez la rate en faisant attention de ne pas la presser avec des pinces ou de la couper pour éviter de perturber l’architecture de la rate.

5. Fixation de la rate avec du paraformaldéhyde (PFA)

1. Préparez la solution fixatrice en mélangeant 3,75 ml de PBS et 3,75 ml de L-lysine 0,2 M. Ajouter 21 mg de m-periodate de sodium et bien mélanger. Ajouter ensuite 2,5 mL de PFA à 4 % et 20 μL de 12 N NaOH.
   note: Utilisez la solution fixatrice le même jour et jetez l’excédent. Ne le stockez pas. Cette étape de fixation est importante si l’échantillon contient des protéines fluorescentes telles que la GFP. N’utilisez pas de PFA contenant des traces de méthanol, car il dénature les protéines fluorescentes.
   prudence: Le PFA est toxique et doit être manipulé avec prudence.
2. Immergez la rate dans le fixateur et fixez-la pendant au moins 4 h, généralement 16 à 20 h à 4 °C sous une légère agitation.
3. Jetez la solution fixatrice et ajoutez 5 mL de PBS pendant 5 min à RT sous une légère agitation.
4. Remplacer le PBS par 5 mL de PBS frais et incuber pendant 1 h à 4 °C en agitant doucement.
5. Remplacer le PBS par 5 ml de saccharose à 30 % et incuber pendant 12 à 24 h
   note: Cette méthode permet de maintenir la morphologie des tissus. Après l’incubation avec une solution de saccharose, l’organe doit couler au fond du puits.

6. Congélation et coupe

1. Mettez de la glace sèche dans un grand récipient et placez à l’intérieur un récipient plus petit contenant environ 50 ml de méthanol pur et quelques morceaux de glace sèche.
2. Séchez doucement la rate avec une lingette non pelucheuse.
3. Placez la rate à l’intérieur d’un moule de base contenant une goutte de composé à température de coupe optimale (OCT) au fond. Attention à ne pas produire de bulles. Ajoutez de l’OCT sur la rate.
4. À l’aide d’une pince, déposez le moule de base sur la surface du méthanol, en vous assurant qu’il ne touche pas l’OCT. Congelez le tissu aussi rapidement que possible pour minimiser les artefacts.
5. Lorsqu’il est congelé, procédez au sectionnement.
   note: La rate gelée peut être conservée à -80 °C pendant plusieurs mois.
6. Sectionnez le tissu à l’aide d’un cryo-microtome.
   1. Réglez la température de la chambre sur le cryostat à -21 °C. Coupez des sections de l’épaisseur souhaitée (généralement autour de 10 μm). Ce protocole fonctionne avec des épaisseurs allant jusqu’à 30 μm.
7. Collectez des coupes sur des lames de microscope en verre (voir le tableau des matériaux) et inspectez-les visuellement.
   note: Les sections peuvent être conservées à -80 °C pendant plusieurs mois.

7. Coloration immunofluorescente

1. Laissez la section arriver à RT.
2. Tracez un cercle avec un bloqueur de liquide (par exemple, un stylo PAP) autour de la section du tissu. Dessinez en dehors de l’OCT ou il ne collera pas.
3. Une fois sec, réhydratez l’échantillon en plaçant du PBS sur la section du tissu pendant 5 min
   note: Le volume mis sur la section dépend de la taille de la section. Nous utilisons généralement 100 à 300 μL. Ne laissez pas les sections sécher une fois qu’elles sont réhydratées.
4. Rincez avec du PBS au moins deux fois pour vous assurer que la section adhère bien à la lame.
5. Ajoutez une solution bloquante à la section pour diminuer la liaison non spécifique des anticorps.
   1. Préparez la solution bloquante comme suit : PBS avec 0,1 % de Triton X100, 2 % de sérum de veau fœtal (FCS), 2,5 μg/mL d’inhibiteur des récepteurs Fc (anti-souris CD16/32). Ajoutez ensuite 2 à 5 % de sérum normal de l’espèce de chaque anticorps secondaire du panneau de coloration.
      note: Si les anticorps sont directement conjugués/biotinylés, ajoutez 5 % de sérum normal de l’espèce de chaque anticorps primaire. Si un anticorps primaire et l’un des anticorps secondaires sont de la même espèce (par exemple, un anticorps primaire élevé chez le lapin et un anticorps secondaire chez le lapin anti-rat), n’utilisez pas l’espèce sérique normale car cela augmenterait le signal de fond.
   2. Retirer délicatement le PBS de la section par aspiration et ajouter 100 μL de solution bloquante par section d’échantillon. Incuber dans une chambre humide couverte pendant au moins 1 h à RT.
6. Coloration avec des anticorps primaires.
   1. Diluer les anticorps primaires à la concentration optimale dans la solution bloquante. Le point de départ général de la concentration d’anticorps est de 5 μg/mL, mais il doit être optimisé pour chaque anticorps et tissu.
      note: Si les anticorps sont directement conjugués, centrifuger le mélange d’anticorps à 17,135 x g (13,500 tr/min) pendant 15 min à 4 °C avant de l’utiliser. Les fluorophores peuvent précipiter. Cette étape permettra de granuler les précipités et d’empêcher ainsi le dépôt non spécifique des anticorps précipités sur la lame.
   2. Remplacez la solution bloquante par le mélange d’anticorps primaire pour chaque échantillon.
   3. Incuber pendant 4 h à RT ou une nuit (OVN) à 4 °C dans une chambre humide couverte.
7. Effectuez le lavage.
   1. Préparez le tampon de lavage en ajoutant 2 % de FCS au PBS.
   2. Laver 4 fois avec un tampon de lavage : une rapide (sans incubation), une pendant 10 min et deux pendant 5 min. Effectuez ensuite un dernier lavage avec du PBS pendant 5 min.
8. Coloration avec des anticorps secondaires.
   1. Diluer les anticorps secondaires d’intérêt à la concentration optimale dans la solution bloquante. Centrifugez le mélange, comme décrit pour les anticorps primaires.
   2. Retirez la solution de lavage finale. Ajouter le mélange d’anticorps secondaires sur le dessus de la section et incuber pendant 1 à 4 h à RT dans une chambre humide couverte.
9. Laver 4 fois avec un tampon de lavage : une rapide (sans incubation), une pendant 10 min et deux pendant 5 min. Effectuez ensuite un dernier lavage avec du PBS pendant 5 min.
10. Retirez la solution de lavage finale. Laissez le PBS s’évaporer mais ne séchez pas trop la section. Placez une goutte du support de montage sur l’échantillon et placez soigneusement le verre de protection sur celui-ci. Le support de montage doit récupérer toute la section. Qu’il polymérase OVN à RT protégé de la lumière.
    note: Tracez un cercle autour de la section au dos de la glissière avant d’appliquer le support de montage. Une fois le support de montage appliqué, le tissu peut devenir difficile à voir.
11. Stockez les diapositives dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à prendre l’image.

8. Imagerie et analyse

1. Effectuer l’imagerie de la coloration avec un microscope confocal.
   note: Dans ce protocole, un microscope à balayage laser spectral inversé a été utilisé (voir Tableau des matériaux), avec les objectifs 10x/NA 0,40 ou 60x/NA 1,4 (pour l’analyse de la localisation subcellulaire des cytokines). Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont affichées pour chaque fluorophore et protéine fluorescente dans le tableau des matériaux.
2. Effectuer des analyses et des quantifications au besoin à l’aide d’un logiciel de traitement d’images (p. ex., Imaris ou Fidji).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Brefeldin A	Biosciences de Cambridge	CAY11861
paraformaldéhyde	Agar scientifique	Réf. R1018
Dichlorhydrate de L-lysine	Sigma lifescience	L5751
Méta-parodaté de sodium	Thermo Scientific	Référence 20504
D(+)-saccharose	Produits chimiques VWR	Référence 27480.294
Lingettes de précision en papier Kimtech science	Kimberly-Clark Professionnelle	Référence 75512
Composé O.C.T., milieu de montage pour la cryotomie	Produits chimiques VWR	Référence 361603E
Bloc Fc, anti-souris purifié CD16/32, clone 93	Biolégende	101302	Clone d’anticorps et concentration utilisée : 2,5 mg/ml
Lames de microscope - Superfrost Plus	Produits chimiques VWR	Référence 631-0108
anti-CD169 - AF647	Biolégende	142407	Clone d’anticorps et concentration utilisée : clone 3D6.112 1,6 mg/ml
			Longueur d’onde d’excitation : 650
			Longueur d’onde d’émission : 65
anti-F4/80 - APC	Biolégende	123115	Clone d’anticorps et concentration utilisée : clone BM8 2,5 mg/ml
			Longueur d’onde d’excitation : 650
			Longueur d’onde d’émission : 660
anti-B220 - PB	Biolégende	Référence 103230	Clone d’anticorps et concentration utilisée : clone RA3-6B2 1,6 mg/ml
			Longueur d’onde d’excitation : 410
			Longueur d’onde d’émission : 455
anti-IFNg - biotine	Biolégende	505804	Clone d’anticorps et concentration utilisée : clone XMG1.2 5 mg/ml
anti-IFNg - BV421	Biolégende	505829	Clone d’anticorps et concentration utilisée : clone XMG1.2 5 mg/ml
			Longueur d’onde d’excitation : 405
			Longueur d’onde d’émission : 436
anti-Nkp46/NCRI	Systèmes de R&D	AF2225	Clone d’anticorps et concentration utilisée : chèvre 2,5 mg/ml
IgG-FITC anti-chèvre	Novusbio	NPp 1-74814	Clone d’anticorps et concentration utilisée : 1 mg/ml
			Longueur d’onde d’excitation : 490
			Longueur d’onde d’émission : 525
Streptavidine - PE	Biolégende	405203	Clone d’anticorps et concentration utilisée : 2,5 mg/ml
			Longueur d’onde d’excitation : 565
			Longueur d’onde d’émission : 578
streptavidine - FITC	Biolégende	405201	Clone d’anticorps et concentration utilisée : 2,5 mg/ml
			Longueur d’onde d’excitation : 490
			Longueur d’onde d’émission : 525
Monture Fluoromount G	SouthernBiotech	Référence 0100-01
Verres de protection 22x40mm	Menzel-Glazer	12352128
Bloqueur de liquide super PAP PEN mini	Axxora	CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - Logiciel d’analyse d’images par microscopie	Plan binaire
Microscope confocal - Olympus FV1200 Microscope à balayage laser	Olympe
Cryostat - CM 1900 UV	Leica
Moule de base jetable	Fisher Scientific UK Ltd	11670990
PBS 1X	Life Technologies Ltd	20012068
Bouillon BHI	Marque VWR	Référence 303415ZA
GFP			Longueur d’onde d’excitation : 484
			Longueur d’onde d’émission : 507
Dp			Longueur d’onde d’excitation : 558
			Longueur d’onde d’émission : 583
Seringue à insuline, avec aiguille, 29G	VWR International	BDAM324824
C57BL/6 souris de type sauvage	Rivière Charles