Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Purification plaquettaire
REMARQUE : La purification des plaquettes doit être effectuée à température ambiante pour éviter leur dégradation. Assurez-vous que la température des réactifs et des instruments est comprise entre 18 et 22 °C. Pour éviter la dégradation des plaquettes, un pipetage rapide et des secousses vigoureuses doivent être évités pendant la procédure.
- Ajouter 600 μL de milieu à gradient d’iohexol (poudre d’iohexol à 12 % dans du chlorure de sodium à 0,85 %, 5 mM de tricine, pH 7,2) dans un tube de 1,5 mL.
- Ajoutez lentement 200 μL d’échantillon de sang sur le côté du tube au-dessus du milieu dégradé à l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre, de sorte que le sang et le milieu iohexol ne se mélangent pas (Figure 1A).
- Centrifuger le tube contenant l’échantillon à 400 x g pendant 20 min à 20 °C dans un rotor à godets oscillants à accélération et décélération lentes.
- Prélever la majeure partie de la couche riche en plaquettes et une petite fraction de la couche pauvre en plaquettes (total 300 à 400 μL) à l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre sans perturber les couches de globules rouges et de globules blancs (figure 1B). Transférez l’échantillon de plaquettes dans un nouveau tube.
note: Si le nombre de plaquettes est inférieur dans le sang ou si un plus petit volume de sang est utilisé, la couche riche en plaquettes et la couche pauvre en plaquettes peuvent être considérées comme une seule couche.
- Ajouter 1 mL de PBS à l’échantillon de plaquettes, mélanger en inversant et centrifuger à 800 x g pendant 10 min à 20 °C dans un rotor à godets oscillants. Jetez complètement la solution et ajoutez 200 μL de PBS pour remettre les plaquettes en suspension avec un pipetage doux.
note: Cette étape est facultative, car elle élimine le milieu de gradient et les protéines plasmatiques et augmente la sensibilité des plaquettes aux agonistes tels que la thrombine. Étant donné que différentes centrifugeuses ont des programmes différents, l’accélération/décélération lente peut être déterminée en lisant le manuel d’utilisation de la centrifugeuse.
- Transférez 30 μL de cet échantillon dans un nouveau tube pour compter les plaquettes. Les plaquettes restantes peuvent être utilisées pour des tests biochimiques et physiologiques tels que l’activation plaquettaire, l’agrégation, la libération de granules, etc.
- Pour l’extraction d’ARN ou de protéines, centrifugez l’échantillon de plaquettes à 800 x g pendant 10 min pour granuler les plaquettes. Jetez complètement le surnageant sans déranger la pastille. Ajoutez le volume souhaité d’ARN ou de tampon de lyse protéique pour lyser les plaquettes.
2. Activation plaquettaire
- Dans un tube, ajoutez 1 à 2 millions de plaquettes purifiées dans un maximum de 100 μL de tampon de coloration (PBS avec 2 % de sérum de veau fœtal, FBS).
- Pour un nombre multiple d’échantillons, faites un mélange maître d’anticorps avec 1 μL (0,5 mg/mL) des éléments suivants : PE-Cy7 anti-souris TER 119, PE rat anti-souris CD45, FITC rat anti-souris CD41 et APC rat anti-souris/humain CD62P (P-selectin) pour détecter les globules rouges, les globules blancs, les plaquettes et les plaquettes activées, respectivement. Ajoutez le mélange principal dans les tubes pour colorer les cellules. N’ajoutez pas de thrombine.
- Dans un autre tube, ajoutez 1 à 2 millions de plaquettes purifiées dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration et 0,4 mM de peptide GPRP. Ajoutez de la thrombine pour activer les plaquettes et colorer les cellules en suivant l’étape 2.2.
note: Le GPRP doit être ajouté à l’échantillon avant d’ajouter de la thrombine pour empêcher la formation d’agrégats ou de caillots par activation plaquettaire. La concentration en thrombine doit être optimisée pour obtenir une bonne activation des plaquettes. Après l’activation plaquettaire, le nombre d’événements est diminué lors de l’acquisition des échantillons par cytométrie en flux.
- En tant que témoin positif, ajoutez 1 μL de sang total dans un tampon de coloration d’au plus 100 μL dans un tube et 0,4 mM de peptide GPRP. Ajoutez de la thrombine pour activer les plaquettes. En tant que témoin négatif, ajoutez 1 μL de sang total dans un maximum de 100 μL de tampon de coloration. N’ajoutez pas de thrombine à l’échantillon témoin négatif. Colorez les cellules en suivant l’étape 2.2.
- Pour le contrôle de l’isotype de la cytométrie en flux, étiquetez 5 tubes avec des tubes non colorés, PE-Cy7, PE, FITC et APC. Ajoutez 100 μL de tampon de coloration, 1 μL de sang et 1 μL de l’anticorps respectif dans les tubes marqués pour colorer les cellules.
- Incuber les échantillons à colorer pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
- Lavez les échantillons en ajoutant 1 mL de tampon de coloration dans chaque tube. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à température ambiante. Jetez soigneusement le tampon de coloration sans déloger la pastille.
- Ajoutez 300 μL de tampon de coloration dans chaque tube, mélangez doucement et transférez dans un tube FACS. Conservez les échantillons colorés dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient analysés avec un cytomètre en flux.
