Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des milieux, des solutions enzymatiques et des animaux
- Préparez de l’alcool iodé à 1 % en dissolvant 1 g d’iode dans 100 ml d’éthanol.
- Préparez 2 x 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Dulbecco sans Ca2+ et Mg2+ complétés chacun avec 7,5 ml de D-glucose (100 g/L) et 5 ml de solution mère de pénicilline/streptomycine 100x (15 mg/ml de D-glucose, 50 U/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine finale).
- Supplément 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 milieu avec 5 ml 100x pénicilline/streptomycine solution mère (50 U/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine finale).
- Préparez une solution de trypsine-DNase I (2,5 mg/ml de trypsine et 10 μg/ml de DNase I) en ajoutant 25 mg de trypsine et 0,1 ml de DNase I (1 mg/ml de DNase I) à 9,9 ml de PBS.
- Dissoudre 50 mg d’inhibiteur de trypsine dans 5 ml de PBS pour solution d’inhibiteur de trypsine A (10 mg/ml). Dissoudre 25 mg d’inhibiteur de trypsine dans 10 ml de PBS pour une solution d’inhibiteur de trypsine B (2,5 mg/ml).
- Pour une solution de collagénase-hyaluronidase-désoxyribonucléase I (DNase I), dissoudre 10 mg de collagénase A (1 mg/ml final), 10 mg d’hyaluronidase (1 mg/ml final) et 0,1 ml de DNase I (1 mg/ml de DNase I) (10 μg/ml final) dans 10 ml de PBS.
- Préparez une solution d’hyaluronidase-DNase I en ajoutant 10 mg d’hyaluronidase (1 mg/ml final) et 0,1 ml de solution de DNase I (1 mg/ml) (10 μg/ml final) à 9,9 ml de PBS.
- Commandez des rats Wistar à temps afin qu’ils aient 19 jours le jour de l’isolement cellulaire de Sertoli.
note: Le protocole décrit est conçu pour 10 rats, mais peut être modifié pour un minimum de 5 et un maximum de 20 rats. Les volumes de toutes les solutions doivent être ajustés en conséquence.
Dans le protocole suivant, une « pipette » est l’abréviation d’une pipette sérologique.
2. Préparation des tubes séminifères
- Anesthésier 10 rats Wistar mâles un par un dans un dessiccateur à l’aide de CO2 et d’un débit qui déplace au moins 20 % du volume de la chambre par minute. Attendez que la respiration s’arrête, testez l’anesthésie en pressant un coussinet plantaire et, s’il n’y a pas de réaction, euthanasiez chaque rat par luxation cervicale. Drainez le sang en sectionnant la veine jugulaire et l’artère carotide (vagin carotica) sous l’eau courante. Désinfectez l’abdomen en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 %.
- À l’aide d’une pince, soulevez la peau des muscles abdominaux et découpez un lobe cutané de forme ovale qui s’étend de la symphyse pubienne au sternum (figure 1A) et battez-le vers le haut sur la poitrine. Ensuite, saisissez les muscles abdominaux et faites une incision médiale de la symphyse pubienne au sternum.
- Serrez l’abdomen avec les pouces du bassin vers le haut afin de pousser les testicules hors du bas du bassin. Retirez le coussinet adipeux de l’épididymaire (figure 1B) à l’aide d’une pince pour tirer davantage le testicule vers le haut. Coupez le cordon spermatique (Figure 1B), en laissant la tunique albuginée intacte, et prélevez tous les testicules dans 20 ml de PBS dans un tube conique de 50 ml (Figure 1C).
- Après avoir prélevé tous les testicules, désinfectez-les en ajoutant un volume égal (20 ml) d’iode à 1 % (p/v) dans de l’éthanol. Retournez le tube deux fois et décantez immédiatement le surnageant. Lavez rapidement les testicules deux fois avec 25 ml de PBS chacun (Figure 1D).
- Transférez les testicules dans une boîte de Pétri contenant 15 ml de PBS (Figure 1E). Saisissez fermement chaque testicule à l’aide d’une pince à une extrémité, faites une petite incision dans la tunique albuginée à l’extrémité opposée et essorez les tubules à l’aide de lames de ciseaux fermées comme outil de grattage.
note: Les tubules doivent toujours former un faisceau compact en forme de testicule avec seulement quelques tubules s’étendant dans la solution afin de permettre une digestion enzymatique homogène (Figure 1F).
- Transférez les testicules décapsulés dans un flacon à bouchon à vis de 100 ml contenant 10 ml de solution de trypsine-DNase I. Effectuer la digestion au bain-marie agité à 32 °C (120 oscillations/min). Après 4 min, évaluez les tubules à l’œil nu pour la dispersion des tubules. Une fois que les tubules commencent à se disperser dans la solution, arrêtez immédiatement la digestion. Si nécessaire, poursuivre l’incubation jusqu’à 2 min.
- Arrêtez la digestion de la trypsine en ajoutant 5 ml de la solution A, inhibitrice de la trypsine. Mélangez soigneusement la solution en pipetant de haut en bas 3 à 4 fois à l’aide d’une pipette de 10 ml et transférez-la dans un tube conique de 50 ml.
- Après 5 minutes d’incubation, observez les tubules se déposer par unité de gravité, retirez soigneusement le surnageant à l’aide de la pipette de 10 ml de l’étape 2.6 et ajoutez 10 ml de solution d’inhibiteur de trypsine B afin d’arrêter complètement la digestion de la trypsine. Remettez les tubules en suspension en pipetant de haut en bas 2 à 3 fois.
- Afin d’éliminer les cellules interstitielles contaminantes, lavez les tubules 9 fois avec 25 ml de PBS chacun. Remettre les tubules en suspension à chaque lavage à l’aide d’une pipette de 25 ml et les laisser se déposer par unité de gravité pendant 10 min. Utilisez toujours la même pipette de 25 ml pour le pipetage du PBS, la remise en suspension et l’élimination du surnageant.
3. Retrait/isolement des cellules péritubulaires (PTC)
- Transvasez tous les tubules dans un flacon à bouchon à vis de 100 ml et ajoutez la solution de collagénase-hyaluronidase-DNase I (figure 2A). Effectuer la digestion pendant 10 min dans un bain-marie à 32 °C (120 oscillations/min).
- Pipetez une goutte de la suspension sur une lame de verre et vérifiez rapidement les tubules au microscope à lumière inversée pour une culture cellulaire de routine à un grossissement de 100x. Si la digestion n’est pas assez avancée, poursuivre l’incubation pendant 2 minutes supplémentaires (ne pas compter le temps nécessaire pour le contrôle microscopique).
note: Au cours de cette étape, tous les tubules sont raccourcis en longueur et les bords des tubules doivent devenir rugueux (figures 2B et C). Les bords rugueux sont révélateurs de la libération de cellules péritubulaires.
- Transférez la suspension avec les tubules digérés dans un tube conique de 50 ml à l’aide de la pipette de 25 ml de l’étape 2.8. Lavez le flacon de 100 ml avec du PBS de 10 ml et ajoutez-le aux tubules du tube conique. Laissez les tubules digérés se déposer par unité de gravité pendant 10 min, et aspirez soigneusement le surnageant, contenant les PTC, à l’aide de la pipette de 25 ml, et transférez-le dans un nouveau tube conique. Pour l’aspiration des derniers millilitres, utilisez une pipette de 5 ml afin d’éviter tout transfert de tubules.
4. Isolement des cellules de Sertoli (SC)
- Remettez en suspension les tubules décantés à partir de l’étape 3.3 dans 25 ml de PBS à l’aide d’une pipette de 25 ml et laissez-les se déstabiliser par gravité unitaire pendant 12 min. Utilisez la même pipette de 25 ml pour le pipetage du PBS, la remise en suspension des tubules et l’élimination des surnageants. Répétez le lavage 3 fois (4 lavages au total).
- Après le dernier lavage, transférez les tubules digérés dans un autre flacon à bouchon à vis de 100 ml contenant la solution d’hyaluronidase-DNase I. Effectuer la digestion au bain-marie agité à 32 °C (120 oscillations/min).
- Après 5 minutes, vérifiez à nouveau les tubules par une inspection microscopique légère à un grossissement de 100X comme décrit à l’étape 3.2.
note: Les tubules courts, les agrégats tubulaires et les cellules libérées doivent être visibles (figure 2D).
- Laisser reposer les agrégats tubulaires pendant 10 minutes et aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 25 ml. Laver les agrégats 4 fois avec 25 ml de PBS et un temps de sédimentation de 10 min pour chaque étape de lavage (Figure 2E).
- Ajouter 20 ml de RPMI 1640 medium et passer la suspension 10 fois à travers une aiguille de 18 G montée sur une seringue de 20 ml. Évitez les bulles d’air.
note: Tirer la suspension vers l’intérieur et vers l’extérieur à travers l’aiguille est considéré comme un seul passage. La rupture et l’homogénéisation des cellules par cisaillement hydrodynamique est une technique standard dans la préparation des cellules qui ont tendance à s’agréger. Il est peu probable que le passage des cellules à travers une aiguille hypodermique de petit diamètre intérieur ait un impact sur leurs propriétés fonctionnelles. Les figures 3C et D montrent l’ultrastructure normale des cellules de Sertoli purifiées au jour 4 de la culture.
- Pipeter une goutte de suspension sur une lame de verre et vérifier rapidement les tubules au microscope à lumière inversée pour une culture cellulaire de routine à un grossissement de 10X si les agrégats sont tous dispersés (Figure 2F). Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 μm afin d’obtenir une suspension unicellulaire pure dans le filtrat.
- Centrifuger le filtrat de l’étape 4.4 à 200 x g pendant 10 min à RT sans utiliser la pause. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de 25 ml et remettez en suspension les cellules de Sertoli dans un milieu RPMI 1640 de 40 ml (sans sérum).
- Mélangez une suspension cellulaire de 100 μl avec 100 μl de colorant bleu trypan et comptez les cellules avec une chambre Neubauer Improved. Ajustez la concentration cellulaire à 3 x 106 cellules/ml en fonction du résultat du comptage. Grainez 1 ml par puits sur une plaque à 6 puits (=jour 1). note: Les cellules Sertoli en suspension se déposent rapidement, de sorte que le tube doit être brièvement secoué à chaque fois avant qu’une aliquote cellulaire ne soit prélevée avec la pipette. Jusqu’au jour 4, ils s’attachent fermement au substrat.
