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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Isolement des lymphocytes T Vδ1
- Prendre <1 x 106 lymphocytes isolés pour une FACS initiale déterminant la fréquence des lymphocytes T CD4 Vδ1.
note: La taille de la population de cette entité à cellules T peut varier considérablement entre les individus et en fonction de leur état immunologique. En règle générale, environ 1 % des lymphocytes T sont Vδ1+ et environ 1 à 5 % des cellules Vδ1+ sont CD4+.
- Diluez les cellules avec 1 ml de tampon FACS, composé de PBS contenant 2 % de FCS et 5 mM d’EDTA. Centrifuger à 660 x g pendant 2 min et décanter le surnageant. Le volume de reflux d’environ 100 μl de tampon FACS est suffisant pour la coloration ultérieure. Vortex brièvement et incuber les cellules avec 5 μl de réactif bloquant Fc pendant 5 min à RT pour une spécificité accrue de la coloration FACS.
- Ajoutez des anticorps monoclonaux humains directement dans les cellules sans retirer le réactif bloquant Fc. Assurez-vous de colorer les cellules avec des anticorps contre Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) et TCRαβ (1:25). Préparez le contrôle des isotypes avec les isotypes d’immunoglobulines correspondants. Incuber des cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Lavez les cellules dans un tampon FACS de 1 ml (centrifugeuse pendant 2 min ; à 660 x g), décantez le surnageant et procédez à l’acquisition du FACS dans le volume tampon restant.
- Granuler les cellules (qui ne sont pas utilisées dans l’analyse FACS) par centrifugation pendant 12 min, à 300 g, à 8 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 60 μl de tampon MACS pour 1 x 107 cellules. Ajouter 20 μl de réactif bloquant Fc par 1 x 107 cellules et incuber pendant 5 min à 4°C.
- Ajoutez 10 μl d’anticorps anti-humains Vδ1 conjugués à la FITC par 1 x 107 cellules directement dans les cellules. Incuber pendant 12 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Laver les cellules à l’aide d’un tampon MACS de 14 ml (centrifugeuse pendant 12 min ; à 300 g ; 8 °C). Jetez complètement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un tampon MACS de 80 μl par 1x107 cellules.
- Prenez 1-2 x 105 cellules et diluez-les dans un tampon FACS de 100 μl pour la vérification de l’étiquetage par analyse FACS. Aucun autre additif n’est nécessaire pour cette étape. Assurez-vous qu’il y a une différence suffisante de luminosité pour les cellules Vδ1- et Vδ1+. Si ce n’est pas le cas, répétez les étapes 1.3 et 1.4.
- Ajouter 20 μl de microbilles anti-FITC par 1 x 107 cellules aux cellules restantes, bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4 °C. Ensuite, laver les cellules à l’aide d’au moins 10 ml de tampon MACS (centrifugeuse pendant 12 min, à 300 x g ; 8 °C).
- Pendant la centrifugation, équilibrez la colonne magnétique pré-refroidie placée dans un aimant avec un tampon MACS de 500 μl.
- Remettez les cellules en suspension dans une mémoire tampon MACS de 500 μl (pour les nombres de cellules supérieurs à 1 x 108, augmentez ce volume en conséquence) et appliquez soigneusement les cellules sur la colonne. Récupérez le flux contenant les cellules Vδ1-.
- Lavez la colonne trois fois avec un tampon MACS de 500 μl et récupérez à nouveau le flux dans le même tube. Notez que le réservoir doit être vide avant d’appliquer un tampon sur la colonne.
- Retirez la colonne de l’appareil magnétique et placez-la dans un tube conique de 15 ml. Rincez rapidement la colonne avec 1 ml de tampon MACS en poussant fermement le piston dans la colonne. Prélever l’éluat dans un tube.
REMARQUE : Afin d’obtenir une pureté de >98 %, il est généralement nécessaire de répéter les étapes 1.7-1.9 avec une deuxième colonne.
- Vérifiez la pureté des cellules par analyse FACS avec le même panel d’anticorps que précédemment (voir 1.1.2) et comptez les cellules.
2. Isolement des lymphocytes T Vδ1CD4+
- Remettre en suspension 25 μl de billes de CD4 à l’aide d’un tourbillon pendant >30 sec. Laver les billes (la quantité minimale indiquée par le fabricant) dans un tampon MACS de 1 ml dans un tube réactionnel de 1,5 ml en plaçant le tube dans un aimant pendant 1 min. Jeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette à petite échelle (200 μl) et remettre les billes en suspension dans le volume d’origine du tampon MACS.
- Granulez les cellules Vδ1+ (centrifugeuse pendant 12 min ; à 300 x g) et aspirez le surnageant et remettez en suspension toutes les cellules Vδ1+ dans un tampon MACS de 500 μl et ajoutez-les dans le tube contenant les billes. Mélanger vigoureusement et incuber pendant 20 min à 4 °C avec une inclinaison constante (par exemple, dans un rotateur).
- Placez le tube contenant les cellules dans un aimant pendant 2 min. Assurez-vous qu’il n’y a pas de restes dans le couvercle.
REMARQUE : Les cellules CD4+ auront lié les billes magnétiques et se fixeront sur le côté du tube face à l’aimant.
- Ouvrez soigneusement le couvercle tout en maintenant le tube à l’intérieur du dispositif magnétique et collectez le surnageant qui contient les cellules CD4-Vδ1+ à l’aide d’une pipette à petite échelle. Placez les cellules CD4-Vδ1+ dans un tube séparé et placez à nouveau ce tube dans l’aimant pour éviter que des cellules ou des billes CD4 ne restent de la population.
- Laver les cellules CD4- dans un tampon MACS de 5 ml (centrifugeuse pendant 12 min ; à 300 x g) et les remettre en suspension à une concentration de 1 x 105 cellules par 100 μl de milieu. Les cellules CD4- peuvent être facilement cultivées dans des conditions appropriées.
- Placez le tube avec les cibles de cellules CD4+ en dehors du champ magnétique, remettez les cellules en suspension dans un tampon MACS de 500 μl et remettez-les dans le dispositif magnétique. Répétez les étapes 2.3-2.5 deux fois pour obtenir une pureté plus élevée. Éliminer le surnageant par pipetage.
- Remettre en suspension les cellules CD4+ dans un milieu de culture de 100 μl (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine) et ajouter 10 μl d’une solution de détachement de billes. Incuber à RT pendant 45 min avec une inclinaison constante (par exemple, dans un rotateur).
- Placez les cellules dans un aimant pendant 1 min. Prélevez soigneusement le surnageant contenant des cellules Vδ1+CD4+ sans billes à l’aide d’une pipette à petite échelle.
- À l’extérieur de l’aimant, remettre les billes en suspension avec un milieu de culture de 100 μl et répéter les étapes 2.6 et 2.7 deux fois pour obtenir un nombre plus élevé de cellules CD4+.
- Granulez les cellules (centrifugeuse à 300 x g, pendant 12 min) et éliminez complètement le surnageant par pipetage. Remettez les cellules en suspension dans un milieu frais et préchauffé et comptez-les. Examinez la pureté des cellules Vδ1+CD4+ par l’analyse FACS décrite aux étapes 1.1.1 à 1.1.3.