Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Génération de NET
- Stimuler les neutrophiles avec 500 nM de PMA (pour 30 ml de solution de neutrophiles) et incuber sur une boîte de culture de tissus plats de 150 x 25 mm avec une grille de 20 mm pendant 4 h à 37 °C 5 % de CO2. Cela permettra à NETosis.
- Après 4 heures de stimulation, aspirez doucement et jetez le milieu, en laissant la couche de TNE et de neutrophiles collée au fond. Ne perturbez pas cette couche.
- À l’aide d’un total de 15 ml de PBS froid sans Ca et Mg par plat, laver le fond de chaque plat en pipetant 15 ml de PBS sur le fond du plat afin de retirer tout le matériau adhérent par le bas.
- Prélever la solution obtenue en lavant chaque plat (étape 1.3) dans un tube conique de 15 ml et centrifuger pendant 10 min à 450 x g à 4 °C. Les neutrophiles et toutes les cellules restantes se granulent au fond, laissant un surnageant riche en TNE acellulaire.
- Répartir le surnageant dans des tubes de micro-centrifugation de 1,5 ml et faire tourner pendant 10 min à 18 000 x g à 4 °C. Cela permettra à tout l’ADN de granuler.
note: La centrifugation dans des tubes plus grands est plus facile et prend moins de temps si des vitesses aussi élevées sont réalisables sur la centrifugeuse ordinaire, sinon il faudra diviser les surnageants dans des tubes plus petits afin d’utiliser une micro-centrifugeuse à grande vitesse.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension toutes les pastilles obtenues ensemble dans du PBS glacé à une concentration correspondant à 2 x 107 neutrophiles pour 100 μl de PBS. Cela produira le stock de NET acellulaire qui pourra être utilisé pour des expériences ultérieures.
- Mesurer la concentration d’ADN dans l’échantillon obtenu à l’aide de la spectrophotométrie ou d’un autre outil de quantification de l’ADN. Une concentration adéquate dans l’échantillon doit se situer entre 140 et 180 ng/μl.
