Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparez-vous à l’avance
- Préparez un milieu complet : RPMI complété par 2 mM de L-glutamine, 100 unités/ml de pénicilline, 100 ug/ml de streptomycine et 10 % de FBS.
- Préparez le milieu DNase : 50 ml de milieu RPMI complété par 7,5 μg de DNase (Préparer frais, garder sur glace en tout temps).
- Préparez le milieu de la collagénase-DNase : 5 ml de milieu DNase plus 3,2 mg/ml de la collagénase de type IV (faites frais, gardez sur la glace en tout temps).
- Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C.
- Incubateur à agitateur chaud à 37 °C.
2. Isolement, dissection et isolement cellulaire des blocs gingivaux
- Euthanasier les souris en les exposant au CO2 dans une chambre appropriée, conformément aux directives de l’Animal Research Advisory Committee (ARAC).
- Ouvrez les cavités thoracique et abdominale pour exposer le cœur et les organes internes. Pour perfuser, faites une incision dans la veine cave inférieure et perfuser 3 ml de PBS par le ventricule gauche à l’aide d’une seringue de 3 ml avec une aiguille de 27 G.
- Immobilisez le corps et la tête de la souris sur un coussin, le ventre vers le haut.
- Coupez chaque commissure de la lèvre vers le cou avec des ciseaux, en séparant la peau qui recouvre la mandibule et la région du cou, et en exposant les tissus et les muscles sous-jacents. Disséquez la lèvre inférieure pour découvrir la mandibule.
- Coupez entre les incisives inférieures pour séparer les deux côtés de la mandibule et immobilisez chaque côté pour accéder à la cavité buccale.
- Visualisez et disséquez le palais en l’éloignant de la cavité nasale.
- Disséquez les zones à l’aide d’une lame à 10 lames et incluez les zones molaires maxillaires et mandibulaires avec la gencive environnante (Figure 1). Faites des incisions verticales juste en avant de la première molaire et en arrière de la troisième molaire, ainsi qu’une incision horizontale au bord de la gencive (collet blanc du tissu entourant les dents).
- Placez les blocs maxillaire et mandibulaire dans un tube conique de 50 ml avec 5 ml de collagénase/DNase (à conserver sur de la glace).
- Incuber dans un incubateur à 37°C pendant 1 h et pendant les 5 dernières minutes d’incubation, ajouter 50 μl de 0,5 M d’EDTA.
- Ajoutez 5 ml de média DNase froid dans le tube de 50 ml avec des mouchoirs en papier et remuez doucement pour mélanger.
- Transférez les 4 blocs de tissu dans une boîte de Pétri et recouvrez-les de 500 μl de média DNase. Retirez la gencive de chaque bloc de tissu, à l’aide d’une lame de scalpel et en pointant la lame dans les zones gingivales et interdentaires.
- Transférez les tissus et les milieux de la boîte de Pétri ainsi que les milieux DNase précédents utilisés lors de la dissection dans un nouveau tube de 50 ml à travers la passoire cellulaire (taille 70 μm). Laver avec un média DNase (3-5 ml) tous les instruments utilisés et filtrer.
- À l’aide du piston d’une seringue stérile de 3 ml, écraser le tissu contre la passoire, en filtrant avec un média DNase froid (30 à 35 ml).
- Lavez la crépine cellulaire avec un média DNase froid.
- Centrifugeuse à 4 °C, 314 x g pendant 6 min.
- Jetez le surnageant et mettez-le à nouveau en suspension dans 1 ml de milieu complet.
- Comptez les cellules (la quantité attendue doit varier entre 8 x 105 et 1,2 x 106 cellules avec une viabilité de >80 %) à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
