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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Échantillons de tissu pulmonaire
REMARQUE : Pour les études in vivo du tissu pulmonaire, étudiez les échantillons après l’exposition pertinente. L’exposition la plus pertinente pour cette expérience est celle des micro-organismes infectieux, en particulier des bactéries. Les souches de souris qui pourraient être utilisées pour cette méthode sont les souris C57BL/6 ou BALB/c, âgées de 10 à 12 semaines, pesant de 25 à 30 g et mâles.
- Euthanasier des souris, via une injection intrapéritonéale de kétamine (400 mg/kg) et de xylazine (40 mg/kg). Ouvrez la cavité thoracique et exposez les poumons et le cœur à l’aide de pinces chirurgicales et de ciseaux.
- Perfuser du PBS chaud à l’aide d’une aiguille de calibre 21 dans le ventricule droit pour éliminer le sang des vaisseaux pendant 30 s, puis perfuser 10 mL de fixateur PLP à 2 % pendant 30 s (dans le ventricule droit).
- Utilisez du PBS chaud (42 °C) pour laver la cavité thoracique ouverte. Intuber la trachée à l’aide d’une aiguille de calibre 21 et d’un morceau de tube de 0,8 mm coupé à la bonne taille, et injecter 800 μL de solution d’agarose préchauffée (à 42 °C) à bas point de fusion à 3 %.
- Attachez la trachée avec de la soie tressée (4.0 USP). Placez le fil autour de la trachée, juste en dessous du point d’insertion de la canule, et fixez-le via un simple nœud plat. Pour solidifier l’agarose, administrez du PBS glacé autour des poumons. Retirez les poumons et le cœur en bloc de la cavité thoracique à l’aide de ciseaux et d’un dissection contondante. Prélever chaque poumon individuellement, puis les fixer pendant 16 h dans du PLP à 2 % ou du formol à 4 °C.
- Conservez les échantillons dans du PBS à 4 °C jusqu’à la section des tissus.
- Pour préparer les échantillons de tissu pulmonaire, suivez les étapes suivantes.
- Fixez les tissus pulmonaires (réséqués à l’étape 1.1) dans du formol tamponné naturel à 10 % pendant 24 h à température ambiante. Transférer à de l’éthanol à 75 % et introduire dans un processeur de tissus sur un cycle de 12 h (2,5 h dans de l’EtOH à 75 %, 3 h dans de l’EtOH absolu, 3,5 h dans le solvant 3B et 3 h dans de la paraffine).
- Intégrez-le dans de la paraffine standard pour créer des blocs FFPE (Formalin-Fix-Fix-Within-Ning) qui sont stockés à température ambiante.
note: À ce stade, il est généralement pratique de couper les sections pulmonaires pour les lames standard.
- Coupez les sections pulmonaires FFPE à 4 - 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome et montez-les sur des lames chargées et revêtues.
- Pour monter des diapositives, placez 3 gouttes de support de montage sur des lamelles de 60 mm x 24 mm (taille 1,5), inversez la glissière sur la lamelle et poussez l’excès de support. Fermez-les hermétiquement avec du vernis à ongles et conservez-les à température ambiante.
2. Préparation/Microscopie d’échantillons de tissus pulmonaires
- Pour déparaffiner, réhydrater et prétraiter l’échantillon de tissu pulmonaire FFPE avec une solution de récupération d’antigène.
- Faites sécher les lames FFPE au four pendant 60 min à 60 °C. Ensuite, mettez les lames dans une solution de xylène pendant 30 minutes et transférez-les dans une solution d’éthanol à 70 % pendant 5 minutes à température ambiante. Rincer à l’eau du robinet.
- Placer dans une pellicule plastique résistante à la chaleur et soumis à la récupération de l’antigène HIER dans un autocuiseur pendant 10 min dans 10 m/mol/L de Tris, 1 mmol/EDTA pH 9,0. Laisser refroidir pendant 20 min. Laver deux fois à l’eau du robinet pendant 5 min sur un transat, puis une fois avec du PBS sur un transat.
- Bloc avec 10 % de sérum de poulet dans 5 % de BSA/PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Teindre le tissu.
- Pour définir les MET dans les macrophages, ajoutez des anticorps primaires (MMP-9, H3Cit et F4/80) dans 1 % de BSA/PBS pendant 16 h à 4 °C à une dilution de 1/100 (des détails spécifiques sur les quantités d’anticorps sont énumérés dans la table des matières). Lavez deux fois avec du PBS pendant 5 min sur une bascule.
- Réaliser une détection fluorescente par incubation avec les anticorps secondaires correspondants dans 1 % BSA/PBS pendant 40 min à température ambiante. Les anticorps sont : (1) anti-souris de poulet 488 (vert), (2) anti-chèvre de poulet 594 (rouge) et (3) anti-souris d’âne 647 (rouge lointain).
- Lavez les sections dans du PBS et montez-les avec un support de montage contenant du DAPI pour la coloration de la chromatine.
- Obtenez des images fluorescentes à l’aide d’une tête de balayage laser confocale fixée à un microscope inversé.
- Excitez la préparation avec des lasers 405, 488, 561 et 647 nm. Capturez des images à plan unique de 512 x 512 pixels en cliquant sur le bouton de mise à niveau séquentielle de ligne (moyenne de 2 lignes) à l’aide d’objectifs à air 20X 0,1 NA et 40X 1,0 NA à huile.
- Obtenir au moins dix champs de vision par section pour l’analyse et des données pour chaque résultat (c’est-à-dire 10 champs de vision haute puissance (HFOV) pour le contrôle, 10 pour l’échantillon stimulé, etc., pour chaque souris).
note: Pour obtenir un échantillon représentatif de l’ensemble du champ, on peut utiliser un système matriciel dans lequel le champ est divisé en différentes sections, et pour chaque échantillon différent, la même matrice est utilisée pour sélectionner les champs de vue (par exemple, le champ peut être divisé en 9 sections, et à partir du centre et des 4 coins, deux HFOV sont pris).