Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
REMARQUE : Un flux schématique de la méthode est décrit à la figure 1.
1. Préparation du matériel
REMARQUE : Préparez tous les réactifs de manière aseptique dans une hotte stérile, aliquotez-les et conservez-les à la température indiquée. Les réactifs peuvent être conservés jusqu’à 2 ans sans perdre leur effet.
- Préparer l’AFC contenant 20 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis comme décrit ci-dessous.
- Ajouter 100 mg de M. tuberculosis H37RA lyophilisé (voir le tableau des matériaux) et cinq billes d’acier de 3,2 mm dans un tube de 7 mL (voir le tableau des matériaux). Agitez le tube dans un homogénéisateur (voir tableau des matériaux) pendant 60 s à la vitesse la plus élevée (5 000 tr/min).
- Ajouter 5 ml d'adjuvant de Freund incomplet dans le tube et agiter à nouveau pendant 60 s à la vitesse la plus élevée. Transvaser la suspension de M. tuberculosis homogénéisé dans l’IFA (maintenant appelée CFA) dans un tube frais à l’aide d’une pipette, en laissant les billes derrière, et conserver à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
- Ajoutez de l’eau ultrapure à la poudre lyophilisée du peptide MOG35-55 (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une concentration finale en peptide de 10 mg/mL. Stérilisez la solution en la faisant passer à travers un filtre de 0,2 μm. Préparez des aliquotes de 60 μL et conservez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.
note: Le peptide MOG35-55 utilisé pour cette expérience est de pureté ImmunoGrade (~70 %), est clivé par TFA, se dissout facilement dans l’eau et contient un amide C-terminal (-NH2) pour augmenter la stabilité in vivo. Les aliquotes peptidiques n’ont jamais été décongelées et recongelées plus de deux fois, et ont été stockées à -20 °C jusqu’à leur utilisation.
2. Préparation d’émulsions CFA/peptides
- Calculez la quantité d’émulsion nécessaire pour l’immunisation. Dans ce protocole standard, chaque souris reçoit 50 μg du peptide MOG35-55 et 300 μg de M. tuberculosis dispersés dans l'adjuvant de Freund (CFA). La quantité de chaque réactif (peptide MOG35-55, PBS, CFA et IFA) nécessaire à la préparation des émulsions peut être calculée à l’aide du fichier supplémentaire 1. Un supplément de 20 % de tous les réactifs, pour compenser la faible perte d’émulsion, est inclus dans le calcul.
note: Le kit d’émulsion commercial (voir le tableau des matériaux) utilisé dans cette étude comprend un tube, un bouchon à vis et un piston dans un sachet stérilisé. Chaque tube du kit d’émulsion contient un maximum de 9,6 mL, ce qui permet de préparer 8 seringues de 1 mL suffisantes pour immuniser 40 souris (ou 80 souris si vous utilisez 100 μL d’émulsion par animal).
- Placez le tube à bouchon vissé (du kit d’émulsion commerciale) et les réactifs à utiliser sur de la glace.
- Ajoutez les composants de l’émulsion dans l’ordre suivant dans les volumes calculés à l’étape 2.1 : PBS, puis le peptide, puis M. tuberculosis dans le CFA, et enfin l’IFA.
- Fermez fermement le tube avec le capuchon en le serrant et en le desserrant plusieurs fois. Agitez vigoureusement le tube pendant 5 à 10 s à la main pour pré-mélanger les réactifs.
- Placez le tube dans l’homogénéisateur à secouer et fixez-le avec la tige. Réglez la vitesse sur le réglage le plus élevé et le temps sur 60 s. Une fois la course terminée, placez le tube sur de la glace pendant 3 min. Répétez l’exécution une ou deux fois de plus avec les mêmes paramètres.
- Centrifuger le tube à 300 x g pendant 1 min pour éliminer l’air emprisonné et compacter l’émulsion.
- Retirez le capuchon du tube, insérez le piston dans le tube et poussez-le lentement vers le bas jusqu’à ce qu’il atteigne le haut de l’émulsion. Retirez la fermeture à pression au bas du tube en la tournant.
- Retirez le piston d’une seringue d’injection (1 mL ; voir le tableau des matériaux). Ajoutez une aiguille (de préférence 25-27 G) dans la seringue d’injection.
- Fixez l’extrémité arrière de la seringue d’injection au verrou dédié au bas du tube et verrouillez-le avec une courte rotation.
- Transférez l’émulsion du tube à la seringue d’injection en poussant doucement le piston. Arrêtez-vous lorsque l’émulsion atteint la graduation de 0,15 mL de la seringue d’injection.
- Séparez la seringue d’injection du tube et insérez le piston avec précaution, en veillant à ce qu’aucun air ne pénètre dans la seringue. Poussez le piston jusqu’à ce que l’émulsion sorte de l’aiguille.
note: À ce stade, une partie de l’émulsion peut être utilisée pour le contrôle de la qualité (voir étape 3).
- Répétez les étapes 2.8-2.11 pour le reste de l’émulsion présente dans le tube.
note: Pour minimiser le gaspillage d’émulsions CFA/antigènes coûteuses, des seringues de 1 ml doivent être utilisées. D’autres seringues qui s’adaptent au verrou dédié au bas du tube peuvent être utilisées ; Cependant, il peut être nécessaire de préparer un plus grand volume d’émulsion. L’émulsion peptidique CFA/MOG35-55 peut être stockée à 4 °C jusqu’à 15 semaines sans perdre sa capacité d’induction d’EAE.
3. Contrôle de la qualité de l’émulsion
- Test de chute : Ajouter une petite goutte de l’émulsion dans un tube conique stérile de 50 mL rempli de 20 mL d’eau froide. Fermez le tube et secouez-le à la main pendant quelques secondes. L’apparition de minuscules gouttelettes distinctes confirme la formation d’une émulsion eau dans huile.
- Examinez l’émulsion à l’aide de la microscopie à contraste de phase.
- Pour analyser la taille des particules d’eau dans l’huile, ajoutez une petite goutte (2-3 μL) de l’émulsion à une lame de microscope, étalez-la avec une lamelle, puis poussez fort dans un mouvement circulaire pour aplatir l’émulsion.
- Examinez l’émulsion frottée à l’aide d’un microscope à contraste de phase (voir le tableau des matériaux) avec un grossissement de 400x et concentrez-vous sur un champ avec une monocouche de l’émulsion. Assurez-vous que de petites particules grises/blanches uniformes sont visibles (Figure 2A).
